Centrifugation bactéries

[aulie]

Bonjour,

J'ai centrifugé 25 mL d'une suspension d'E.coli à 1500 rpm pendant 15 min. Et j'ai ensuite fait un isolement sur mon surnagent pour vérifier sa "pureté".

Résultat : Il été bien remplie. (Tellement que je crois avoir que 2 ou 3 colonies isolés)

Mon but étant naturellement de récupérer toutes les bactéries dans le culot et donc d'avoir un surnagent sans - ou presque - bactéries, afin de concentré ma suspension.

A combien régler ma centri et la faire tourner pendant combien de temps ?
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[Flyingbike]

Premiere chose importante : parler d'un protocole de centri en rpm (ou tour par minutes) n'a pas de sens puisque le rapport entre RPM et g (ou rcf) dépend du rotor. Pour qu'un protocole soit reproductible entre différentes centrifugeuses il faut s'intéresser a l'équivalent en g.

Je ne comprends pas pourquoi tu veux "concentrer". Apres 15 min a 1500 rpm (meme si je ne sais pas ce que ca fait en g) tu devrais voir un culot. Récupérer ce qu'il reste dans le surnageant ne devrait pas changer grand chose.

Tu peux cependant essayer ce qui est conseillé pour les preps, par exemple 3 min à 6800g.

[kamor]

On parle plutôt en G car selon la centri, le nombre de tours min ne donnera pas le même nombre de G.
Mais 1500 rpm ça me parait très léger, je travaillais à 8 000g 10 min pour culotter des cellules
@flyingbike, vous êtes plus rapide que moi mais son but est d'obtenir un surnageant "pur", sans coli donc ça se comprend.
Attention quand même, je suppose que vous recherchez bien quelque chose dans ce surnageant, si vous montez trop dans les G, vous risquez de le précipiter en même temps que vos cellules

[aulie]

Merci pour vos réponses.

En faite ma centri indique sa vitesse en rpm et non en g d'où le faites que j'ai indiqué cet unité.

Comment calculé g ?

J'ai trouvé des calculator en ligne, mais ça ne présage rien de bon.
Ma centri tourne jusque 5000 rpm. Son rayon étant d'environ 15cm, ce qui fairais du 2240g.

Je veux "concentrer" car je travail sur une norme de PSM qui me dit qu'il faut minimum 5.10^8 UFC/mL. J'atteinds tous juste 1.10^8. Donc je centrifuge et remet en suspension dans un volume réduit.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Mais vous avez peur d'en perdre beaucoup dans le surnageant?
Si il est limpide c'est que les bactéries sont bien culotées. Je ne pense pas que vous parviendrez à obtenir un surnageant stérile quoi que vous fassiez comme centrifugation.
Remarquez bien que si vous avez 2-3 bactéries/100µl, ça ne vous en fait que que 500 à 750 pour 25 ml de milieu. Comparé à vos 10⁸ c'est parfaitement négligeable.

Maintenant, je n'ai peut être pas bien compris l'intérêt d'obtenir un surnageant propre. Si vous en avez réellement besoin, vous pouvez toujours le filtrer. Là, il existe des filtres si fins qu'ils retiennent les bactéries.

Cordialement,
piwi

[aulie]

Si le surnagent n'est pas stérile ça n'a pas d'importance.

Si j'avais fait un isolement pour voir s'il y avait encore bcp de bactérie, c'était parce qu'il était encore fort trouble.
J'ai obtenue un culot, mais vue que je veux concentrer le plus possible, il me faut donc répérer le plus possible de bactéries.

Lors de ma prochaine manip je la mettrais beaucoup plus fort, je l'avais pas mis à plus car j'avais peur que les cellules se fragélisent de trop.

[invite762b5721]

Je tournerai au moins 5000g pendant quelques minutes.
et peut-être reprise du surnageant dans un 2è tube puis retourner un peu pour voir si un culot se forme à nouveau.