Résultats de purification de lysozymes

[invitee316e232]

Bonjour!

j'ai un rapport de tp à remettre, j'espère vraiment que vous me répondrez avant ce soir... je suis comme qui dirait en retard. Voilà mes questions.

TP - extraction du lysozyme.

A quoi sert le calcul de l'activité catalytique?Afin de la déterminer on a mis en présence du micrococcus et nos fractions obtenus lors de la chromatographie échangeuse de cations.
On a obtenue la quantité de lysozyme présents dans chacunes des fractions, et calculer à partir de la variation d'absorbance par minute le nombre d'unité d'enzymes.On a eu a calculer l'activité spécifique, le nombre d'unité enzymatique, et la quantité de protéines totale dans chaque fraction??? Pourquoi?

Ensuite on a effectuer une électrophorèse, l'électrophorèse étant qualitative, il faut de forte concentration en enzymes (ça je le sais...) dans la fraction Fo (ya toutes les protéines) F1(adsorption) F2 à F4 (normalement que les protéines - voir rien du tout en F4) c'est le lavage, puis la désorption en F5 et F6 ( ou on ne doit avoir que du lysozyme au vue de mes résultats que j'affiche plus bas) tout a marché sauf en F4 où il n'y a que du lysozyme. je vous mettrai le gel aussi (voir plus bas). Comme en F5 et F6 (vu la perte en lysozyme) il y avait une faible concentration on a du utiliser des tubes à concentré, avec les fractions de nos collègues , on a placé dans le tube et mis à concentré, ok je suis d'accord avec ça. Mais notre prof nous fait calculer le volume initiale (avant centrifugation) puis volume finale (après concentration) afin de calculer le facteur de concentration. MAIS A QUOI çA PEUT BIEN ME SERVIR???????
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[invitee316e232]

désolée de l'énormité de mes caractères!!

[nowell]

Bonjour !!

ça sent la L2 ou la L3 de mémoire en bioch tout ça !!

Je n'ai pas réellement saisi votre interrogation concernant la deuxieme question.
En revanche votre première question fait appelle à une réponse somme toute assez évidente.
Pourquoi vous faire calculer l'activité catalytique d'une enzyme...
Bien! Une enzyme présente des caractéristiques propres de célérité, ces valeurs définissent l'enzyme même. Donc on vous fait calculer l'activité catalytique de l'enzyme pour la connaitre pardi !
Micrococcus est une bactérie (gram- il me semble) qui est sensible au lysoszyme. Aussi les valeurs de DO durant la lyse permet de connaitre de nouvelles valeurs petit à petit de la destruction des bactéries ( du moins, de leur membrane externe) et donc de connaitre l'activité enzymatique.

[invitee316e232]

Bonjour,
Merci de la réponse, en effet je suis en L3 - rapport de Travaux pratique...

Votre réponse me va très bien. Et j'ai réussi à élucider le mystère mais il me reste une question.

On a utilisé des marqueurs pour l'électrophorèse avec des protéines ne venant pas de l'oeuf, mais ayant des origines diverses!!!
Les fractions dont je vous parle sont originaire de notre purification par chromatographie échangeuse d'ions par centrigugation, ou plus exactement de cation.
F0 contient toute les protéines on lui fait subir l'adsorption on obtient normalement F1 (protéines plus lysozyme non fixé) plus le culot (cm cellulose avec les lysozymes fixée).
Lavage de F1 à F4
Puis F5 et F6 sont les fruits de la désorption. Quand je calcule la concentration je vois des concentration de 0,1 à 0,02 de lysozyme, ce qui est trop faible pour faire une électrophorèse. Car il faudrait que je dépose plein plein plein, beaucoup beaucoup de la solution pour avoir un gel convenable... (vous comprenez ce que je veux dire???) Alors pour ça on utilise une tube à concentré. On a un volume initiale de solution après centrifugation, les 3/4 du liquide sont dessendu dans le fond tube on prélève le filtrat, onlit un volume appelé volume final. On calcul le facteur de concentration Volume final/ volume initial. Mais mais mais, je ne vois pas à Quoi ça peut servir. surtout que je ne connais pas la concentration des fractions qui m'ont été passées par mes collègues... donc

A quoi me sert le facteur de concentration?????

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee316e232]

Une autre question il faut une concentration minimal de combien en protéine pour souhaiter la voir en électrophorèse? je dépose 25 ul de solution par puit.

[Flyingbike]

il n'y a pas de règle, tout dépend de la protéine que tu veux voir, du type d'extraits, de la sensibilité de la révélation.....

[invitee316e232]

il n'y a pas de règle, tout dépend de la protéine que tu veux voir, du type d'extraits, de la sensibilité de la révélation.....

ok... ben alors à quoi sert d'utiliser les tubes à concentrer, et le calcul du facteur de concentration??