Contrôle négatif clonage

[invite65d2efbb]

Bonsoir,

J'ai un compte rendu à faire pour lundi mais je bloque pas mal sur un certain point et ayant encore trouvé aucunes réponses à ma question sur internet, je m'en remet à vous.
Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif ??
Après culture sur milieu sélectif additionné d'ampicilline, on a obtenu plus de colonies pour notre clonage que sur la boite du contrôle (il y avait des colonies sur la boite du contrôle, normalement il devrait pas ne pas en avoir ??). Je n'arrive pas à comprendre exactement pourquoi nous avons eu plus de colonies et ce que nous devrions retrouvés sur la boite de contrôle...

J'ai été brève dans mes explications, si vous avez besoin d'un élément supplémentaire pour répondre à ma question, je reste à votre disponibilité.

Merci d'avoir pris du temps pour lire mon sujet
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[invite65d2efbb]

Personne pour m'aider ???

[invite563835f6]

Je m'étonne de quelque chose: est ce ton vecteur ou ton insert qui contient le gène de résistance à l'ampicilline ?

Normalement, c'est ton vecteur. Donc en principe, le contrôle qui contient uniquement le vecteur doit permettre à la cellule transformée de résister à l'ampicilline.

[invite563835f6]

Je rajouterai que dans une expérience de transformation les différents contrôles à réaliser sont les suivants:

- controle positif: vecteur seul => développement des cellules sur milieu sélectif, car le gene de sélection est contenu dans le vecteur qui est contenu dans les cellules
- controle négatif: pas d'ADN => pas de développement des cellules sur milieu sélectif, car le gene de sélection n'est pas présent dans les cellules

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite65d2efbb]

C'est le vecteur qui possède le gène de résistance.
Donc effectivement, on peut avoir culture sur le contrôle puisque le vecteur est résistant à l'ampicilline (j'ai tendance à pas mal m'embrouiller avec tout ça). D'après ce que tu dis pour le contrôle négatif, un vecteur qui n'a pas inséré d'insert ne va pas entrer dans les bactéries lors de la transformation bactérienne et du choc thermique ? Le vecteur ne peut pas entrer seul dans les bactéries ?

[invite563835f6]

je n'ai pas dit ça. ce que je dis c'est que dans un contrôle négatif, on transforme les bactéries avec de l'eau (en fait, on ne les transforme pas), alors que dans un contrôle positif, on les transforme avec le vecteur seul.

généralement, on réalise d'autres transformations avec d'autres mélanges qui permettent de déterminer:
- l'efficacité de transformation de vos bactéries : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide contrôle (=vecteur).
- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.
- bruit de fond dû à l'ADN non digéré : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé sans ligase.
- bruit de fond dû à l'ADN non digéré ou digéré par une seule enzyme : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec la ligase.

[invitee05f2589]

Salut !
Est ce que ton vecteur pour le témoin a été digéré ? si oui est ce que vous avez fait une ligation après (sans insert, juste lui tout seul) ?
Si il s'agit d'un vecteur non ligé il ne sera pas refermé sur lui même et ne pourra donc pas "rentrer" dans les bactéries... = pas de colonies !

[invite65d2efbb]

Nous disposions d'un vecteur déjà ouvert pour la manipulation (il me semble que ce sont les profs qui se sont occupé de l'ouverture) et nous avons bien fait une ligation avec une ligase T4... Donc il est normal qu'il y ai culture si j'ai bien compris... Un vecteur ouvert ne peux pas rentrer dans une bactérie... Ca fait un point d'éclaircit merci...
Il m'en reste encore un autre, je ne comprend toujours pas comment est-ce possible qu'on ai plus de colonies sur notre boite sur sur le contrôle. Est-il possible que nos colonies soient constituées de vecteur sans insert (le vecteur se serait refermé sur lui même) de vecteur avec l'insert dans le bon sens ou de vecteur avec l'insert dans le mauvais sens? Pourtant nous avons mis le même nombre de vecteur pour le clonage ou pour le contrôle...

[invite563835f6]

Peux tu préciser exactement ce que tu as inséré et le phénotype de tes bactéries ainsi que le milieu de culture exact ?
Peut être que tu as fais de la complémentation fonctionnelle...

[invitee05f2589]

Dans tes colonies "vecteur+insert" il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase ! Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle...
Désolé là je répond pas à ta question, je viens juste de penser à ça, c'est tout...

[invite65d2efbb]

Nous avons inséré l'ADNc de la pleitrophine, un facteur de croissance et cela dans une souche mutante de E.coli qui est Epicurian Coli XL-1 blue sur un milieu LB. Par contre, je ne connais pas du tout la complémentation fonctionnelle...

Nous avons utilisés la même enzyme de restriction pour l'insert et pour le vecteur (EcoRI)

[invite563835f6]

Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) => il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).

La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert ?

[invitee05f2589]

Un vecteur ne peut pas se refermer tout seul ?!

[invite65d2efbb]

Il me semble que nous en avions pour notre clonage environ 800 colonies pour 60 ng d'insert et pour le controle nous en avions environ 100, je n'ai pas encore les résultats exactes

[invite563835f6]

Un vecteur ne peut pas se refermer tout seul ?!

Si .. ? Aurais je dis le contraire par mégarde ?

En ce qui concerne l'efficacité de ta transformation (vecteur+insert) elle n'est que de 13.10^3 bactéries transformées/µg d'ADN ce qui est faible (une valeur de 10^6 est en général souhaitable).
Il doit donc se passer quelque chose dans ton protocole qui ne fonctionne pas très bien.

Les 800 colonies obtenues sont bien celles qui ont le vecteur+insert n'est ce pas ? Quel marqueur utilises tu pour les différencier de celles qui ne possèdent que le vecteur sans l'insert ? Ex: lorsque l'insert contient LacZ (le gène codant pour la béta-galactosidase) une culture sur milieu contenant du Xgal permet de reconnaitre les bactéries qui ont l'insert car elles sont bleues.

[invitee05f2589]

Si .. ? Aurais je dis le contraire par mégarde ?

nan nan mais il me semblait que ce n'était pas possible...

[piwi]

Bonjour.

Vous n'avez pas explicité c'est quoi exactement, plus de colonies? Combien de colonies avez vous obtenu avec le vecteur seul et avec le vecteur non transformé?

Sinon le sens du contrôle négatif (je ne suis pas certain que cela ait été dit clairement) est d'évaluer indirectement la qualité de la coupure du plasmide. Si après vos restrictions il vous reste du plasmide non coupé, il va transformer. Ce qui est intéressant dans ce contrôle c'est de le comparer à votre boite expérimentale.
Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.

Cordialement,
piwi

[invite563835f6]

nan nan mais il me semblait que ce n'était pas possible...

Si dans le cas où il est simple-digéré... Non ?

[invitee05f2589]

Si dans le cas où il est simple-digéré... Non ?

tu me fout un doute...

[invite65d2efbb]

Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.

[invite65d2efbb]

Je me pose encore une question : est-il possible que le vecteur sans insert rentre moins bien dans les bactéries que le vecteur avec insert ? Je pense que ça na aucune influence mais au cas où...

[invite6d14e0f5]

principe a savoir:
-plasmide + eau = temoin de digestion = seul plasmide non digere integrera les bacteries = presence de qqes clones.
- plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle)
- plasmide + insert + ligase... = essai de ligation
normalement si la boite presente +++ de clones que les 2 temoins ca veut dire que le plasmide a integrer votre fragment d'ADN.

[Flyingbike]

il y a aussi plasmide + insert sans ligase ou tu ne dois pas avoir grand chose.

[invite6d14e0f5]

ce dernier temoin = vecteur + insert sans ligase = n'apporte + infos...
vous utiliserez plus de produit, c'est tout.
puisqu'il y aura jamais de ligation sans ligase, et dc l'ajout de l'insert n'apporte rien. Ce temoin serait equivalent a celui du vecteur seul = temoin de digestion.

[invite563835f6]

Je me permets de faire un petit up avec ce que javais mis plus haut:

- l'efficacité de transformation de vos bactéries : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide contrôle (=vecteur).
- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.
- bruit de fond dû à l'ADN non digéré : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé sans ligase.
- bruit de fond dû à l'ADN non digéré ou digéré par une seule enzyme : nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec la ligase

Je pense que cela contient l'essentiel

[LXR]

ce dernier temoin = vecteur + insert sans ligase = n'apporte + infos...
vous utiliserez plus de produit, c'est tout.
puisqu'il y aura jamais de ligation sans ligase, et dc l'ajout de l'insert n'apporte rien. Ce temoin serait equivalent a celui du vecteur seul = temoin de digestion.

Non car la ligase est une enzyme fragile. Donc contrôler son activité est important dans une manip de clonage, c'est ce que permet de faire ce contrôle par comparaison avec la condition insert+vecteur+ligase. S'il y a un problème quelque part cela permet de savoir plus rapidement d'où il vient, ce qui n'est pas aisé dans ce genre de manip.

Greg

[invite6d14e0f5]

re-salut Greg
prq ajouter de l'insert avec du plasmide mais sans ligase, c'etait ca la reflexion! sachant qu'on a deja un controle plasmide sans ligase et plasmide + ligase, ce qui permettra, comme tu le dis, de verifier entre autre l'activite de la ligase mais surtout que le vecteur est bien digere.
Ces 2 temoins peuvent etre compares aux essais plasmide+insert+ligase.
Je pense que vous avez mal compris mon (mes) commentaire (s).
bonne soiree

[invite65d2efbb]

Merci pour toutes vos réponses !!!
J'ai trouvé la solution au près d'une de mes amies qui fait parti d'un autre groupe de TP et qui n'a pas le même prof. Dans son groupe ils ont fait deux contrôles : vecteur + insert sans ligase et vecteur sans insert avec ligase.
Nous n'avons fait que le controle vecteur sans insert avec ligase, donc du coup j'étais pas mal perturbé mais une fois qu'elle m'a expliqué leur manip et leur résultats, tout a été plus simple (grâce à vos aides aussi, évidemment)
Finalement nous avions bien des plasmides seuls, des plasmides avec l'insert dans le bon sens et des plasmides avec l'insert dans le mauvais sens (nous avons continués le TP aujourd'hui).

Je vous remercie pour vos commentaires et vos suggestions !!
Bonne soirée

[LXR]

re-salut Greg
prq ajouter de l'insert avec du plasmide mais sans ligase, c'etait ca la reflexion! sachant qu'on a deja un controle plasmide sans ligase et plasmide + ligase, ce qui permettra, comme tu le dis, de verifier entre autre l'activite de la ligase mais surtout que le vecteur est bien digere.
Ces 2 temoins peuvent etre compares aux essais plasmide+insert+ligase.
Je pense que vous avez mal compris mon (mes) commentaire (s).
bonne soiree

Comme tu l'as dit : plasmide + ligase = voir les plasmides mal digérés, mal déphosphorylés. Si la ligase est mauvaise, un faible nombre de bactéries transformées sera peu représentatif de l'efficacité réelle de la digestion et surtout de la déphosphorylation. On peut alors partir sur une fausse piste.

Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible. C'est pour cela que je trouve qu'il vaut mieux sortir l'étape de déphosphorylation pour ce contrôle.

Si j'insiste autant sur l'activité ligase, c'est parce-que j'ai déjà eu un problème de sous-clonage à ce niveau, avec une ligase "presque" neuve.

Greg