Induction d'une protéine

[invitee86c41d0]

Bonjour à tous, et joyeuses fêtes !

Je viens à vous pour vous demander quelques éclaircissements concertant un compte-rendu de TP de biochimie / ingéniérie des protéines où j'éssais de surexpirmer, purifier, et enfin vérifier l'acitivé de ma protéine.

La protéine en question est une enzyme, l'adénine désaminase, qui transforme l'adénine en hypoxanthine.

La 1ère étape de la manipulation consiste à mettre au point les conditions de surexpression de cette proteine, pour cela on dispose d'une préculture de bactéries recombinantes permettant de produire l'adénine désaminase, je dois différentes conditions d'inductions ( Milieu LB / Milieu TB) ainsi que variation de la quantité d'IPTG, la DO d'induction est de 0,6.

Mes questions vont surement vous sembler étranges car je n'est pas encore eu le cours corresponds à l'induction des protéines.

Je cherche en vain sur le web un "cours" sur l'IPTG, je sais juste que l'IPTG permet "d'induire " une protéine d'intérêt, ça veut dire que lorsque j'ajoute de l'IPTG à ma culture ma protéine va devenir fonctionnelle ?

Ensuite les milieus LB / TB, cest un milieu pauvre et un milieu riche cest bien ça ?

Dans la série des questions stupdies j'ai un doute sur les mesures de DO éffectuées avec le spectro, ces mesures traduisent l'opacité de ma solution, c'est à dire que plus la valeur de DO grimpe, plus j'ai des bactéries dans ma solution.
Car avant d'ajouter de l'IPTG il faut atteindre une certaine valeur de DO, cela signifie qu'à cette DO on a obtenu assez de bactérie pour pouvoir commencer l'étude ?

Enfin une dernière question, après avoir atteint la DO d'indction et avoir ajouté de l'IPTG a ma culture ( une culture avec IPTG et une culture sans pour la comparaison) j'obtiens des valeurs de DO quasi similaire à chaques temps pour les deux cultures, voir meme un peu inferieur en présence d'IPTG, je m'attendais au contraire étant donné que l'IPTG est sencé induire ma protéine d'intéret. J'aurais pu induire ma protéine autrement ?

Merci à vous, joyeuses fêtes
-----

[invitee86c41d0]

Sinon si vous possédez simplement un lien qui pourrait me diriger vers un cours sur l'induction des protéines, le mécanisme d'action de l'IPTG je suis preneur aussi.

Bonne nuit à vous

[invitee86c41d0]

Up du désespoir

[invitee86c41d0]

Bonne anneé à tous

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

Ca fait beacoup de questions tout ca...

Je cherche en vain sur le web un "cours" sur l'IPTG, je sais juste que l'IPTG permet "d'induire " une protéine d'intérêt, ça veut dire que lorsque j'ajoute de l'IPTG à ma culture ma protéine va devenir fonctionnelle ?

Non l'IPTG est un inducteur. rien a voir avec la fonctionalite de ta proteine. C'est un analogue non metabolisable du lactose. cherche sur l'operon lactose sur le net, tu trouveras tout ce qu'il te faut.

Ensuite les milieus LB / TB, cest un milieu pauvre et un milieu riche cest bien ça ?

LB est riche, TB je ne sais pas mais je pense que ce doit etre un milieu riche aussi.

Dans la série des questions stupdies j'ai un doute sur les mesures de DO éffectuées avec le spectro, ces mesures traduisent l'opacité de ma solution, c'est à dire que plus la valeur de DO grimpe, plus j'ai des bactéries dans ma solution.
Car avant d'ajouter de l'IPTG il faut atteindre une certaine valeur de DO, cela signifie qu'à cette DO on a obtenu assez de bactérie pour pouvoir commencer l'étude ?

Oui c'est ca.

Enfin une dernière question, après avoir atteint la DO d'indction et avoir ajouté de l'IPTG a ma culture ( une culture avec IPTG et une culture sans pour la comparaison) j'obtiens des valeurs de DO quasi similaire à chaques temps pour les deux cultures, voir meme un peu inferieur en présence d'IPTG, je m'attendais au contraire étant donné que l'IPTG est sencé induire ma protéine d'intéret. J'aurais pu induire ma protéine autrement ?

Oui il y a d'autres moyens d'induction, mais dans ton cas seul l'IPTG peut marcher. Tu comprendras tout apres t'etre renseigne sur l'operon lactose

Bonne annee

[invitee86c41d0]

Salut gorben et merci d'avoir pris le temps de répondre à mes questions

J'ai en effet pu trouver des explications en cherchant opéron lactose sur le web, ça ma beaucoup aidé.

L'IPTG est donc une molécule qui va "stimuler" un opéron ( ici l'opéron lactose) et qui va donc augmenter l'activité transcriptionnelle de la bactérie, d'où une augmentation de la synthèse de ma protéine.

J'aurais aimé savoir néanmoins pourquoi il était impossible d'utiliser d'autres moyens d'inductions, c'est parsque je travail à partir de E.Coli ?

Je me demande aussi quels sont les facteurs qui peuvent faire varier l'expression de ma protéine ? le milieu de culture ? la température dans laquelle les bactéries vont évoluer ? la quantité d'IPTG peut être.

Et enfin si j'ai bien compris, c'est normal que mes DO avec IPTG ne soient pas superieur aux DO sans IPTG, car la quantité de bactérie dans ma solution n'est pas liée à la surproduction de protéine engendrée par l'IPTG, dans ce cas je ne vois pas l'intérêt de faire une étude comparative !

Bonne soirée à vous.