Extraction ADN sur gel d'agarose et seconde PCR

[invite364d48af]

Bonjour,

je dois séquencer un génome mitochondrial mais je suis bloquée sur un problème de spécificité de mes amorces qui ne sont pas de la même espèce que mon modèle. Bref pour l'instant il n'est pas question de cloner (ce qui aurait été bien plus rapide!) mais de faire des PCR en prenant exemple sur le modèle publié, de les séquencer puis de voir si on s'y retrouve...

Bien sur, lorsque je réalise ces PCR avec les amorces publiées j'ai de nombreuses bandes non spécifiques et donc je découpe mes bandes d'intérêt sur gel d'agarose puis les passent sur le Nucleo Spin extract II , je vérifie sur un 2nd gel que j'ai bien une bande unique à la taille attendue (ça c'est ok) pour chaque couple de primers et je refait une PCR pour avoir plus de matériel.(lorsque j'essaie de séquencer directement mes séquences sont moches)

Au départ, cette seconde PCR ne fonctionnait pas car je mettait trop de produits de PCR (1µl à 10 à 20ng pour un volume final de 25µl) donc j'obtenais de très beaux smear!!!
Bref j'ai dilué au 1/1000 mes produits de PCR , et là pour certains échantillons c'est ok alors que pour d'autres je me retrouve avec 2 bandes plus petites (ex 500 et 600 bp au lieu de ma bande unique vers 1200bp!) que se passe-t-il ????
De plus pour d'autres échantillons je ne voit pas de bandes (mais j'essaierai de séquencer quand même pour voir ce que cela donne, parfois cela fonctionne bien quand même)

Si certaines personnes ont déjà fait ce genre de manips je suis preneuse de tous vos conseils

Merci et bonne journée

[piwi]

Je me suis déjà amusé à cela avec le même kit que vous et ça n'a jamais bien marché non plus (si ca peut vous rassurer d'une certaine manière)
L'extraction de bande sur gel est quand même une entreprise assez pourrie.

Bon courage.

[invite98ab1ae6]

Ah?
Dans un des labos ou je suis passee, on le faisait de maniere tres "artisanale".
On percait un trou en bas d'un tube 0.5 ml, y mettaient un peu de cotton sterile, le bout d'agarose avec la bande decoupee, mettaient le tout dans tube 1.5, centri, et le tour etait joue. Il me semble que c'etait assez clean pour refaire une PCR derriere, mais je crois qu'on diluait l'extrait avant.
Pour nous ca marchait au moins aussi bien que le kit, mais c'etait surtout pour le cout (la joie de certains labos en France).
Je ne savais pas qu'il y avait des problemes de re-amplification apres extraction d'un gel, j'en ai jamais rencontre moi-meme, en tout cas.
Tu penses que c'est du au rendement ou aux inhibiteurs, Piwi?

[invite364d48af]

Par rapport au kit j'ai des collègues qui travaillent avec mais ils font ensuite du clonage et il n'ont pas de problème; moi j'ai déjà le soucis de partir d'amorces non spécifiques!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite98939c3f]

Bonjour,

des nouvelles de ton problème?
car je rencontre les mêmes en ce moment... je découpe des bandes entre 1000 et 2000pb et kit + seconde PCR... mes fragments amplifiés sont d'environ 500pb (plus ou moins)...

merci

[inviteef0070f1]

Une question rien a voir: Vous etes étudiants? si oui vous faites ces manip en quelle année? ca a l'air chouette

[invite853321bf]

Tu commences à faire des manips par toi même dans les labos en bac+4.
Sinon suivant les facs tu en fais aussi durant les TP, mais ça n'a pas la même saveur

[invite98939c3f]

Tu commences à faire des manips par toi même dans les labos en bac+4.
Sinon suivant les facs tu en fais aussi durant les TP, mais ça n'a pas la même saveur

tu peux aussi en faire si tu le souhaite lors de tes vacances scolaires (généralement après la L3, pendant 2 3 mois) mais vu le temps court tu n'as pas le temps de vraiment manipuler mais ça donne un bon aperçu.
Sinon, moi je suis en M2 à paris 7.

[invite71f23525]

Pourrait-on arrêter le hors-sujet svp?

Merci.

LXR pour la modération

[invitecf0f3574]

Vous devriez esayer une "nested PCR", pour moi ca marche mieu que decouper du gel et c'est plus rapide.
voici une breve description de ce que c'est:
http://en.wikipedia.org/wiki/Nested_...chain_reaction
http://www.chups.jussieu.fr/polys/bi....Chp.8.11.html

[invite98939c3f]

Bonjour,

merci pour ta réponse.
Cependant dans mon cas, je ne peux pas avoir 2 couples de primers.
Je cherche à identifier des gènes avec des primers dessinés sur un autre gène... je ne sais pas où sont insérés les gènes que j'amplifie...

Mais cependant, quand tu fais cette technique, tu ne fais pas de purification sur gel pour récupérer ton produit? (ou une purification de PCR?)

[invite364d48af]

ce qui me surprend vraiment c'est qu'après extraction et passage sur la membrane de NucleoSpin j'ai sur le gel d'agarose de très belles bandes et q'après avec les mêmes conditions de PCR j'ai des bandes beaucoup plus petites?
il ne vous aura pas échappé que 500+600 égal 1100 ce qui correspond à la bande attendue ou du moins découpée!
Bref je retente une PCR dans des conditions différentes de Tm et d'élongation mais bon je ne crois pas pouvoir améliorer la chose...
Si j'ai du nouveau je ne manquerai pas de venir vous en faire part!

Merci