Interaction protéine/protéine - ultrasons

doriancoco · 09/04/2010 - 11h55

Bonjour à tous, je souhaite faire une manip d'immunoprécipitation sur un extrait cérébral de rat (qui contient donc toutes les protéines cérébrales possibles) qui a été soniqué dans du SDS 1% à 100°C, par ultrasons à 40V (assez faible, juste pour casser le morceau de cerveau dans le tampon).
Ma question est simple: cette sonication peut-elle rompre les interactions protéine/protéine entre deux protéines membranaires?

Merci d'avance pour votre aide!

Flyingbike · 09/04/2010 - 12h18

les US je ne sais pas, mais le SDS et la chaleur oui !

doriancoco · 09/04/2010 - 12h21

Merci Flyingbike pour ta rapide réponse =)
Donc je dois faire d'autres homogénats à partir de tissu congelé à -20°C, car ceux avec le SDS me serviront à autre chose (je voulais savoir si ça pouvait faire double-emploi !) ... Aurais-tu une idée de protocole d'IPP pour étudier l'interaction entre 2 protéines membranaires? En effet, je trouve pas mal de choses pour des cultures de cellules, mais à pas à partir de tissu animal !

Flyingbike · 09/04/2010 - 13h32

il te faut préparer un tampon de lyse gentil (style Tris pH7,5, EDTA, NaCl, un détergent "soft (triton, NP-40) et quelques inhibiteurs de protéases (PMSF, aprotinine, leupeptine, pepstatine, NaF....). Ce genre de tampon est relativement facile a faire et a trouver.

Ensuite en fonction de ton tissu, il faut le broyer (dounce par exemple) dans ce tampon, centrifuger pour éliminer les débris et récupérer le surnageant. Tu devrais avoir des protéines natives.
Quel tissu utilises-tu ?

doriancoco · 09/04/2010 - 14h02

Ok je vais faire ça, mon tissu est du cerveau de rat congelé dans l'isopentane et conservé à -20°C... Merci pour le début de protocole, et pour la suite, c'est à dire l'IPP proprement dite, que me conseilles tu?

Flyingbike · 09/04/2010 - 14h05

pour l'IPP je ne sais pas je n'en ai jamais fait. En tout cas pour le tampon de lyse, il te faut un truc gentil pour garder tes protéines intactes (comme pour l'IP, le gel shift, ChIP, etc..). Mais pourquoi congeler tes cerveaux dans l'isopentane pour extraire ensuite des protéines ?

doriancoco · 09/04/2010 - 14h08

isopentane pour bloquer très rapidement toutes les réactions enzymatiques (kinases et phosphatases notamment)

Flyingbike · 09/04/2010 - 14h09

d'accord, mais pourquoi pas l'azote liquide dans ce cas ? Je congele aussi a l'isopentane mais que pour faire des coupes histo ensuite. (c'est juste par curiosité bien entendu)

doriancoco · 09/04/2010 - 14h13

d'abord le cerveau est plongé dans l'azote liquide, et ensuite isopentane pendant 10 sec avant de le conserver à -80°C... D'ailleurs pendant que j'y suis, penses-tu que ce protocole peut abîmer les membranes nucléaires, ce qui pourrait contaminer les protéines du cytosol par des protéines nucléaires ou inversement? En effet, je vais aussi faire un fractionnement subcellulaire avec un tampon sucrose EGTA MgCl2, inhib proteases...

Flyingbike · 09/04/2010 - 14h19

c'est possible, je ne suis pas sur qu'on puisse faire des purs extraits nucléaires sur du congelé. Je fais des extraits nucléaires enrichis après azote, mais il y a des cytoplasmiques dans mes nucléaires et inversement. Pour faire du fractionnement c'est toujours mieux d'utiliser du tissu frais je pense.

doriancoco · 09/04/2010 - 14h35

Ok donc tu penses que je ne peux rien tirer de concluant sur ces manips? J'avais pourtant fait un test en WB en utilisant en contrôle histone pour les nucléaires et actine pour les cytoplsmiques, bilan: la fraction cytoplasmique est bien pure (marquage actine seulement), mais pas la nucléaire (marquage histone + actine), ça arrive souvent...

Flyingbike · 09/04/2010 - 14h41

ben ça dépend totalement de ce que tu veux faire ! pour regarder une localisation cellulaire c'est peut etre pas suffisant (moi aussi j'ai plein d'actine en nucléaire) mais si c'est juste pour enrichir ça peut etre suffisant.

doriancoco · 09/04/2010 - 14h45

en fait c'est pour évaluer la translocation d'une protéine (récepteur cytoplasmique) vers le noyau... tu penses que ça peut être faisable?

Flyingbike · 09/04/2010 - 15h00

ben ça peut poser problème si tu as des extraits nucléaires contaminés par des cytoplasmiques non ? ou alors il faut que tu aies une translocation suffisament franche pour etre visible en WB. Tu n'as pas envisagé d'autres techniques (Immunofluo par exemple) ?
Comme souvent le meilleur moyen de savoir c'est d'essayer

doriancoco · 09/04/2010 - 15h19

J'aimerais faire immunofluo ensuite, oui je vais essayer, on verra bien ce que ça donne... le problème c'est que je pars de très peu de matériel, donc de protéines, car j'étudie des zones du cerveau toutes petites, je dois éviter le gaspillage de prot! :/