Bonjour,
lorsque je réalise une pcr avec un champignon connu dans un puits j'obtiens un seul pic me donnant une seule température de fusion,
donc lorsque je met un mélange de 2 champignons dans un puits, je devrais avoir 2 pics donc 2 températures de fusion, mais je n'obtiens qu'un seul pic qui ne correspond à aucun des 2 champignons du mélange...
Si quelqu'un à une explication, je suis preneur !
Merci
Tu obtiendras 2 pics si
- ton deuxième champi a des séquences complémentaires à tes amorces.
- les deux amorces permettent de créer un amplicon dans les conditions de ta PCR (donc pas trop éloigné quoi)
- que l'amplicon ainsi formé soit différent de celui de ton premier champignon, sinon tu n'auras qu'un seul pic si la longueur des deux est identique.
Sinon là... Ca ressemble à un controle interne mis en excès. En fait si tu as mis trop d'ADN de ton 2ème champi, il peut prendre le pas sur ton premier et complètement inhibé la réaction. et température différente là par contre...
Et si tu mets que ton deuxième champi ?
Et bien justement si je met que le deuxième champi, ça marche comme avec le premier, j'ai bien un seul pic me donnant une seule température (différente du premier champignon) donc c'est pour ça que je comprends pas trop pourquoi avec un mélange des 2 j'obtiens qu'un seul pic....
En tout cas, merci pour ton aide !
Bonjour,
Ton pic correspond peut-être à l'amplification des amorces si celles ci peuvent se dimériser nan?
Je ne pense pas qu'il s'agisse d'amplification des amorces puisque sinon j'aurai ce pic à la même température à chaque fois alors que quand j'utilise des champigons différents je n'obtiens pas la meme température...
Tu pourrais le savoir avec ton témoin positif. Si celui ci ne présente pas de pic, ce n'est pas une dimérisation d'amorces.
Juste pour savoir, ton pic étrange à un Tm supérieur ou inférieur aux deux autres ? Ou entre les deux peut être
Et bien selon les mélanges que j'effectue, le pic ''étrange '' est soit entre les 2 autres (obtenus avec les 2 champignons du mélange séparément) soit inférieur aux deux autres...
Avec mon témoin négatif je n'obtiens aucun pic, donc je n'ai pas de dimérisation d'amorce...
Est-ce que l'appareil qui mesure les Tm ne pourrait pas faire une espèce de moyenne des 2 Tm des champignons?
Moui... théoriquement, le premier amplicon "s'ouvre" donc la vitesses de libération du Sybr augmente, puis au moment où elle diminue, si l'autre commence à s'ouvrir et donc la vitesse continue à augmenter, donc non je pense que ça ferait un plateau.
Ou alors, il faudrait que tes deux Tm soit vraiment très proche, donc dans ce cas, le moment (enfin la t°) où la vitesse de relargage du Sybr de l'un diminue serait la même que celle ou ton autre amplicon commencerait à s'ouvrir, et il faudrait que le conjugué des deux soient plus important que la vitesse instantanée de variation de tes deux amplicons à leurs Tm respectifs.
Théoriquement oui mais dans ce cas, ton pic doit être très large, bien plus que si tu fais un puits avec qu'un des deux. Et les débuts et fin de la courbe doit correspondre au début du pic de ton premier champi (celui avec le Tm le plus faible) et la fin du pic de ton deuxième.
Avec toutes ces restrictions, oui ça pourrait être une moyenne
Oui, j'avais pensé à ça aussi... effectivement pour un mélange j'avais 2 tm de champignons proches et un pic assez large mais en revanche avec un autre mélange de 2 champi de températures très éloignées j'ai un seul pic (à 82°C alors que un des champigons du mélange a normalement un Tm de 89°C...)
Je suis en train d'essayer avec d'autres couples de primers pour voir si j'obtiens la meme chose... je vous tiens au courant !
Merci de votre aide
