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Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

  1. #1
    SNT

    Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

    Bonjour,

    J'ai un problème depuis quelques mois avec des cellules HEK293 EBNA.
    J'ai transfecté les cellules avec mes constructions (à partir de miniprep), jusque là tout allais bien.

    J'ai réussi à faire des testes d'expression de mes protéines qui ce sont tous avérés bon.

    Mais lorsque j'ai voulu les passer en sur-production dans un plus grand volume et maintenant lorsque je veux re-décongeler une ampoule de mon stock j'ai un énorme problème :

    La décongélation se passe bien, les cellules arrivent à adhérer, elles se développent bien sans pression de sélection, mais lorsque je rajoute celle-ci quelque chose d'étrange se passe :

    Les cellules commencent à se décoller, elles perdent leur forme (leur contour devient strillé), en plus de cela, de nombreux débris sont présents dans le milieu ainsi que beaucoup de granules de stress dans les cellules…


    Je n’ai toujours pas identifié les causes de ce problème mais j’en ai éliminé certaines :

    Mis hors de cause :
    DMEM, SVF, gentamycine car les cellules prolifèrent bien dans le milieu sans pression de sélection.
    PBS : ne pose pas de problème.

    Contaminations par bactéries ou levures impossible, car ce genre de contaminations de laisse aucun doute à cause de leurs rapidités.

    Contaminations par micoplasmes, n’explique pas la présence d’autant de débris dans le milieu.


    J'ai remarqué que cela intervenait après l'ajout de la pression de sélection. Donc la puromycine peut être en cause ou alors les cellules elles même, je me demande si elles n'ont pas subi un trop grand nombre de passages surement + de 60 des cellules non transfectées.




    Si quelqu'un peut m'aider...



    Je ne peux malheureusement pas prendre de photos de mes cellules mais si quelqu'un à des exemples de photos de contaminations, qu'il me fasse signe.


    Merci d'avance.

    -----

    "Ne regrette jamais tes erreurs, elles te feront toujours avancer" So

  2. Publicité
  3. #2
    beberp35

    Re : Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

    Bonsoir,

    Il est clair que le nombre de passages est énorme, à environ 40 passages je les jette... Sinon une chose simple, avez vous changé le modèle de vos boites de culture, sachant que les HEK ne sont pas des cellules qui adhèrent fortement au plastique je pense que ce paramètre peut avoir son importance. Sinon petite remarque ... est ce que vos stables résistent bien à la puro?

  4. #3
    Sanvi

    Re : Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

    Question : tes cellules sont bien des clones stables ?

  5. #4
    SNT

    Re : Comportement étrange HEK293 EBNA transfectées

    Merci de vos réponses,

    Alors, oui mes cellules sont des clones stables (en théorie)et mes stables résistaient bien à la puro jusqu'à maintenant....

    J'ai adopté une nouvelle stratégie, vu que faire et défaire c'est toujours travailler, j'ai décongelé une ampoule de HEK 293 non transfectées d'un stock assez ancien (n'ayant pas été passé un trop grand nombre de fois) et je viens de re lancer 10 transfections différentes en parallèle, pour le moment les cellules vont bien même si je constate une efficacité de transformation de l'ordre de 20 % grand maximum avec de la Lipofectamine 2000 ou LTX d'Invitrogen. (J'observe une mort cellulaire importante j'ai donc mis une pression de sélection réduite à 0,5 µg/ml de Puromycine.

    Pour le moment "Wait and See"
    "Ne regrette jamais tes erreurs, elles te feront toujours avancer" So

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