protocole pour rendre des levures compétentes

[invite5bbdf386]

Bonjour à tous

Je dois écrire un compte rendu de TP dans lequel nous devons indiquer le rôle des solutions (HEPES, DTT, eau stérile froide, sorbitol) utilisés pour rendre des cellules de levures compétentes. j'ai déjà fait pas mal de recherche sur internet, mais je n'ai trouvé que des protocoles semblables au notre mais pas à quoi serve les solutions utilisées. Alors aidez moi
Vous trouverez à la suite le protocole que nous avons utilisé.

Protocole :
- Incuber les levures jusqu'à ce que la DO600 atteigne 1.3-1.5
- Centrifuger 5 min à 3000g 4°C dans des pots de centri stériles
- Resuspendre le culot dans 25ml de milieu YPD (milieu de culture) + 5ml d'HEPES 1M pH8
- Ajouter 0.75ml de DTT 1M
- Incuber 15minutes à 30°C
- Ajuster le volume à 125ml avec de l'eau stérile froide
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 62.5ml d'eau stérile froide
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 10ml de sorbitol 1M froid stérile
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 5ml de sorbitol 1M froid stérile
- Conserver dans la glace

Ces cellules sont ensuite utilisées pour être transformées par électroporation.

Je vous remercie d'avance pour vos réponses

Littlelizou
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[Edelweiss68]

Bonjour,

N'en avez vous aucune idée?

Je trouve quand même cela triste de faire bêtement ce qui est écrit sans se poser la moindre question de l'utilité d'ajouter tel ou tel produit! Surtout que le fait de faire un compte rendu ne doit pas être une surprise pour vous...

[invite5bbdf386]

J'ai une idée du rôle de certaines de ces solutions mais pas dans le cas où on utilise ces solutions pour rendre des cellules de levure compétente.
Par exemple, je sais que le DTT est un agent réducteur et qu'il permet de réduire les ponts disulfure dans les protéines. Mais je ne comprends pas son rôle pour rendre des levures compétentes.
Donc si quelqu'un peut m'aider ce serait vraiment chouette.

[noir_ecaille]

Moins qu'une idée, un soupçon...

Protocole :
- Incuber les levures jusqu'à ce que la DO600 atteigne 1.3-1.5
- Centrifuger 5 min à 3000g 4°C dans des pots de centri stériles
- Resuspendre le culot dans 25ml de milieu YPD (milieu de culture) + 5ml d'HEPES 1M pH8
- Ajouter 0.75ml de DTT 1M
- Incuber 15minutes à 30°C
- Ajuster le volume à 125ml avec de l'eau stérile froide
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 62.5ml d'eau stérile froide
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 10ml de sorbitol 1M froid stérile
- Centrifuger 5min 3000g 4°C
- Resuspendre le culot dans 5ml de sorbitol 1M froid stérile
- Conserver dans la glace

Ces cellules sont ensuite utilisées pour être transformées par électroporation.

DSO600 à 1,3-1,5 c'est qu'on a une culture riche, peut-être arrivée à un plateau -- vitesse de croissance nulle ?
Centrifugation pour n'avoir que des cellules d'intérêt et pas d'élément solide du milieu (bout de viande/foie...) ? Les plus grosses structures coulant au fond "en premier" dans le principe.
Suspension en YPD pour obtenir une culture de croissance, HEPES en solution tampon en remplacement du Tris sans le désavantage qu'il réagisse à l'état de trace avec les électrodes.
Le DTT va dénaturer les protéines à ponts cystines. Peut-être les complexes protéiques membranaires.
L'eau froide va suspendre l'action du DTT, notamment parce que HEPES perdra partiellement son rôle tampon avec le froid (moins de dissociations ioniques). + premier lavage pour éliminer le DTT.
Centrifugation et deuxième lavage du DTT (éliminé à la centrifugation consécutive).
Le sorbitol n'est pas fermentescible par les levures, mais il a un grand pouvoir de fixation pour l'eau. Je suppose qu'on veut éviter une dessiccation cellulaire par fuite des ions lors de l'électroporation. Le sorbitol diffuse peut-être au sein de la levure via les canaux protéiques dénaturés, à moins qu'il ne s'agisse d'inactiver un transporteur d'élimination du sorbitol intracellulaire.

C'est tout ce que je peux apporter...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5bbdf386]

merci noir_ecaille

[noir_ecaille]

Sincèrement, il n'y a pas de quoi