Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

[invite2039d1ce]

Bonjour tout le monde,
Nous avons réalisé une PCR en temps réel en TP et nous devons interpréter les résultats et je vous avoue que je bloque un peu ...

J'ai obtenu les Ct (cycle où le seuil est franchi), j'ai fait la régression linéaire (log Concentration ADN par rapport aux Ct) -> J'ai donc la concentration en ADN de champignon des échantillons.
Le problème c'est pour la suite, on doit rendre un résultat "scientifique" (j'ai déjà calculé le % de contamination et je suppose que je doit utiliser les données fournies mais à part la concentration en ADN total, je ne vois pas ce que je dois faire des autres ) et un autre que même l'agriculteur producteur des échantillons est capable de comprendre (importance des dégâts, traitement possible? si oui lequel ...).

Nombre d'Avogadro:N=6,022.10²³
Données:1pb=660Da
taille génome du champignon (Alternaria)=30Mpb
taille génome du végétal "saint"=1000Mpb
Concentration en ADN total des échantillons =10ng/µl

Si quelqu'un peut m'aider ce serait vraiment sympa
Merci d'avance
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[Chewee]

Ton énnoncé n'est pas très clair....

Tu dis avoir fait une régression avec le résultat de tes échantillons...qui devaient être des contrôles avec des concentrations d'ADNc connus afin de réaliser une gamme et de venir placer le résultats de ton échantillons test dessus, n'est ce pas?

Tout d'abord, je dirais qu'il te faudrait une validation expérimentale de ton résultat brute en Ct (as tu des blanc dans ta qPCR afin de savoir à partir de quel cycle sort le signal non spécifique?), avez-vous réaliser une courbe de "melting" permettant de visualiser la spécificiter de ton amplicon?

A partir du moment ou la spécificité de ton amplification d'ADN "champignon" est avéré, il me semble que tu peux en conclure que ton échantillon est positif pour ce champignon: même en faible quantité, ce dernier est présent et se multiplira de toute façon.

Une fois la quantité d'ADN contaminant (champignon) déterminée, tu peux donc estimer la proportion d'ADN total contaminer par cette ADN....mais tu peux surtout, avec les données que tu as, déterminer un nombre de copie. Pour ce faire, applique les formules que tu connais surement:

A partir de la concentration en g/l tu calcules la concentration en mol/l en divisant les g/l par le poids moléculaire en g/mol (ou Da c'est la même chose). De là en utilisant le volume d'échantillon tu calcules la molarité n en mole, puis avec N tu connais le nombre de molécule soit le nombre de copie dans ton cas.

Par la suite, connaissant surement l'espèce incriminé, documentes toi afin de déterminer un mode opératoire afin de traiter et d'éradiquer ce champignon pour aider le producteur.

[invite2039d1ce]

Merci pour ton aide, c'est sympa, ça m'a beaucoup aidée

En effet j'ai fait une "gamme d'étalonnage" (avec différentes dilutions de l'ADN de champignon) qui m'a servie pour ma régression linéaire, j'ai ensuite estimé la Concentration en ADN de champignon des échantillons. Les amorces sont bien spécifiques de la séquence à amplifier et j'ai réaliser 3 répétition de témoin "eau".

Par contre l'un de ces 3 témoins présente un Ct très important (donc très peu d'ADN présent mais pas 0) est ce une contamination (et donc je ne peut pas valider le reste de la manip) ou est ce seulement une sorte de "bruit de fond"?.

Merci d'avance

[Chewee]

Ce témoin doit sortir vers 35 ou 40 ct...celà arrive.

Le fait qu'un seul de tes triplicate ne soit affecter me fais penser à un dimer de primer...ou effectivement une contamination. Si tu veux répondre à cette question, seule une courbe de melting permettrait de l'affirmer.

Dans le cas du dimer, il arrive que les primer s'hybrident entre eux et s'amplifient. Il faut toujours avoir un regard critique sur les intensités de fluorescence en sortie de qPCR et surtout vérifier la spécificité via une courbe de melting à la fin de tes cycles de qPCR, mais à priori vous n'en avez pas faites durant votre TD...

Combien de Ct d'écart entre tes échantillons et ton blanc qui sort?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2039d1ce]

Mon témoin "bizarre" sort à 39,22 Ct et mes échantillons sortent en moyenne à 25,5 pour la première série (3 essais par échantillon) et 30,3 pour l'autre et en effet nous n'avons pas fait de courbe de melting, on nous a juste dit que l'amorce était spécifique de ce pathogène.

[Chewee]

Dans ces conditions ton blanc est juste du non spé.... Car même avec des amorces designées pour être spécifiques ont peut avoir du signal non spécifique.
Sans courbes de melting, afin d'être tranquil, 10Ct ou plus entre ton blanc et ton échantillon est un élément de confiance...

En tout cas ta première série est beaucoup plus contaminée que la deuxième!

Voili voilou

[invite2039d1ce]

Ok Merci beaucoup Ça m'a beaucoup aidée

[Chewee]

Ok Merci beaucoup Ça m'a beaucoup aidée

Pas de quoi ! Et vive la qPCR !

[kamor]

Il ne faut pas oublier non plus que la progression de la concentration dans ton échantillon n'est pas linéaire. Un Ct d'écart entre 2 tubes, ça veut dire que la concentration de tes cibles était de 1 et de 2 entre tes tubes, un écart de 10 Ct c'est 1 et 1024 ! Là 15 Ct d'écart c'est une différence de concentration de 3000, ça fait quand même beaucoup.
De la même manière pour ta courbe d'étalonnage, le coefficient doit être proche de 3.32 (2^3.32 = 10) et on estime qu'il faut que ton R2 soit entre 90 et 110% pour que ton résultat puisse être fiable. Mais bon certains ont moins et utilise quand même, tout dépend du degré de fiabilité que tu veux.
Avoir un positif est très utile, ainsi que la Melt curve. Là tu sais que tu as amplifié mais quoi ? C'est un peu comme si tu faisais une PCR classique et qu'à la fin tu fais une lecture en Spectrophotométrie à 260nm. Tu pourras juste savoir si tu as amplification ou pas.

Après, l'histoire des 30 Ct... Un commercial m'avait dit que c'était des stat, qu'au dessus on estimait que l'amplification ne répondait plus aux lois statistiques auxquelles l'amplification répond (proba que amorces matche avec la bonne séquence) mais j'ai jamais pu trouver le papier expliquant vraiment cela et il avait l'air peu enclin à me donner de lui même le nom du papier.

[kamor]

Trop tard pour l'édition donc...
petite coquille mais d'importance 2^15 = 30 000 et non 3000

[Chewee]

De la même manière pour ta courbe d'étalonnage, le coefficient doit être proche de 3.32 (2^3.32 = 10)

Pourrais-tu être plus précis sur cette information? Tu parles de quel coefficient? La pente de la droite d'étalonnage?

[Chewee]

De la même manière pour ta courbe d'étalonnage, le coefficient doit être proche de 3.32 (2^3.32 = 10)

De plus, il serait plus judicieux de parler d'Efficacité calculée à partir de la pente, en appliquant la formule suivante:

E=10^(-1/a) où "a" est la pente de la droite de régression. De faite, si a=3.32 on obtient E=2.
Ce raisonnement n'est valable que si la gamme a été effectué par des dilutions de raison 2, ton Efficacité traduit la différence de quantité d'échantillon entre chaque point de gamme. Donc si tu as réalisée une gamme de raison 4 tu aurais obtenu E=4.
Ce raisonnement te permet de valider ta gamme...

Lors de l'utilisation d'une gamme, on parle alors de quantification "absolue".

Dans le cas d'une quantification dite "relative" où n'est pas utilisée une gamme de cDNA, le calcule des quantités de cDNA peut alors être 2^-Ct si E=2 (une dilution de raison 2 des échantillons est alors réalisée, mais sans connaissance de la concentration de cDNA cible dans ce même échantillon).Si E=1.8 on aurait calculé cette même quantité de cDNA avec la formule 1.8^-Ct etc....

Ce type de quantification peut par exemple être utilisée en R&D pour comparer l'expression d'un gène après traitement par une drogue vs un contrôle sans drogue. On obtient alors plus une amplitude qu'une quantité...

[Flyingbike]

je ne suis pas d'accord. la pente ne varie pas selon que les dilutions sont en 2, en 3 ou en 5. C'est indépendant. Je fais des dilutions par 3 ou par 5, mon efficacité reste proche de 2 et la pente proche de 3,3.

[invite2039d1ce]

Merci beaucoup pour votre aide

[Chewee]

je ne suis pas d'accord. la pente ne varie pas selon que les dilutions sont en 2, en 3 ou en 5. C'est indépendant. Je fais des dilutions par 3 ou par 5, mon efficacité reste proche de 2 et la pente proche de 3,3.

Autant pour moi, tu as raison, après vérification j'ai effectivement efficacité de 2 quelque soient les dilutions. (encore heureux d'ailleur ! )

J'ai confondu avec la différence de quantité relative d'un point de la gamme à l'autre qui elle, en toute logique, doit correspondre au facteur de dilution si ton efficacité est bien de deux....

[invite2039d1ce]

Bonjour,
Quel est exactement l'intérêt de passer par le nombre de copies dans mon cas sachant que j'ai déjà les Ct (j'ai lu sur un site :
- si Ct supérieur à 28 : contamination ancienne, a priori attribuable à une contamination survenue lors de l’année précédente,

- si Ct inférieur ou égal à 28 : contamination récente et une reprise de la circulation du pathogène )
Donc le nombre de copie peut donner quelle info que ne pourrait pas donner le Ct?

[Chewee]

Bonjour,
Quel est exactement l'intérêt de passer par le nombre de copies dans mon cas sachant que j'ai déjà les Ct (j'ai lu sur un site :
- si Ct supérieur à 28 : contamination ancienne, a priori attribuable à une contamination survenue lors de l’année précédente,

- si Ct inférieur ou égal à 28 : contamination récente et une reprise de la circulation du pathogène )
Donc le nombre de copie peut donner quelle info que ne pourrait pas donner le Ct?

Je ne pense pas que dans ton cas on puisse donner un historique à la contamination par ce champignon. Dans ce que tu as pu lire sur le net, il y avait surement un historique: si à t0 il avait imaginons 25 Ct, puis 28 Ct à t1 après avoir appliqué un traitement, c'est qu'il y a un recul de la contamination, c'est la seule explication que j'ai sur l'info que tu as trouvé.
Il ne me paraît pas très relevant de donner un seuil comme 28 Ct de façon empirique, sans avoir plus précision sur le mode opératoire dans lequel s'inscrit cette "norme".

Le nombre de copie permet de revenir à une sorte d'unité internationale, car à partir des conditions expérimentales qui peuvent varier d'un manipulateur à l'autre (quantité d'ARN de départ, conditions de qPCR, mix utilisés etc...) les Ct peuvent varier. Après une normalisation par un gène de ménage défini et/ou l'utilisation d'une gamme étalon, on s'affranchit de ce genre de problème.

[invite2039d1ce]

Ok merci

[invite2039d1ce]

Bonjour,
Est ce que quelqu'un peut me dire ce que je doit faire avec les tailles des génomes (végétal et fongique)?
Certaines personnes de ma classe ont l'air de dire qu'ils servent pour calculer le % de contamination mais je ne m'en suis pas servie
(pour moi % contamination=[ADN fongique] déterminé grâce à l'équation de droite d'étalonnage/[ADN total => soit 10 ng/µl)

Est ce une erreur (et si oui comment calculer le % de contamination avec ces génomes) où doivent ils être utiliser pour autre chose?

Rappel des données :
Nombre d'Avogadro:N=6,022.1023
Données:1pb=660Da
taille génome du champignon (Alternaria)=30Mpb (=1,98.10^10 Da
=3,288.10^-14 g)
taille génome du végétal "saint"=1000Mpb (= 6,60.10^11 Da
=1,096.10^-12 g)
Concentration en ADN total des échantillons =10ng/µl

Merci d'avance

[Chewee]

Bonjour,
Est ce que quelqu'un peut me dire ce que je doit faire avec les tailles des génomes (végétal et fongique)?

Tu as une quantité totale d'ADN, incluant donc celle du champignon et celle du végétale (10ng/ml x Volume d'échantillon).
Tu as déterminé via ta gamme une quantité d'ADN contaminant.

Tu peux donc effectivement définir un pourcentage de contamination par rapport à la quantité totale d'ADN (ce qui me paraît être le plus simple).

Il faut noté que sauf mention contraire, toutes les données des énoncés ne sont pas forcement à utiliser !! Il faut savoir répondre aux questions le plus simplement possible.

Mais il y a un autre raisonnement beaucoup moins intéressant à mon gout, qui vaut ce qu'il vaut, et beaucoup plus tiré par les cheveux pour calculer ce pourcentage:

D'une part, avec la quantité d'ADN du champignon, tu calcule le "nombre de génome de champignon" que tu as dans ton échantillon (masse d'ADN contaminant/masse du génome du champignon). Tu obtiens n1.

D'autre part, tu soustrais la masse d'ADN de champignon à l'ADN totale pour avoir la masse d'ADN restant, appartenant donc au végétale, et tu calcules le "nombre de génome végétal" que tu as dans ton échantillon (masse d'ADN végétal/masse du génome du végétal). Tu obtiens n2.

Ensuite tu fais un produit en croix qui donne % = n1x100/(n1+n2)
Ainsi tu obtiens un % de contamination par rapport au "nombre de cellules"... (1 cellule=1 fois le génome.....)

Essai avec ça et dis moi ce que ça donne

[invite2039d1ce]

Ok merci beaucoup pour ton aide

Une autre petite question (en PCR classique cette fois)
on a fait plusieurs PCR avec plusieurs types d'amorces :
->"spécifiques"
->"universelles" (ITS1/ITS2)
Quel est l'intérêt des amorces universelles (car je suppose qu'elles sont moins spécifiques que les autres, non?)
Le fait de les mettre en parallèle sert il seulement à comparer la spécificité?

[Chewee]

Ok merci beaucoup pour ton aide

Une autre petite question (en PCR classique cette fois)
on a fait plusieurs PCR avec plusieurs types d'amorces :
->"spécifiques"
->"universelles" (ITS1/ITS2)
Quel est l'intérêt des amorces universelles (car je suppose qu'elles sont moins spécifiques que les autres, non?)
Le fait de les mettre en parallèle sert il seulement à comparer la spécificité?

L'utilisation en PCR des séquences ITS (ADN) dites universelles ont la même utilité que les séquences 18S (ARN) en RT-PCR, à savoir valider la présence d'ADN dans ton échantillon, leur qualité, et éventuellement normaliser tes dépôts. C'est un contrôle positif.

Les séquences ITS et 18S sont ribosomales....

[kamor]

De plus, il serait plus judicieux de parler d'Efficacité calculée à partir de la pente, en appliquant la formule suivante:

E=10^(-1/a) où "a" est la pente de la droite de régression. De faite, si a=3.32 on obtient E=2.

L'efficacité n'est qu'un moyen mathématique de voir si ton coefficient est proche du coefficient "parfait" d'une gamme d'étalonnage. Et comme l'interprétation du coefficient est aussi facile à faire que la lecture des astres...

Les amorces universelles peuvent te permettre d'amplifier tous les génomes comportant ces séquences ITS.
Tu peux donc faire un rapport certain par rapport à ton amplification spécifique.

[invite2039d1ce]

Ok merci