technique de microscopie à fluorescence

[invite2039d1ce]

Bonjour tout le monde,
Je bosse sur une publication scientifique en ce moment et je bloque sur un petit truc (c'est surement pas grand chose mais c'est quand même gênant pour comprendre la suite)

Ils ont réadapté la technique de coloration du pollen du Dr Zagorcheva à l'observation de mycélium sur folioles

Des disques foliaires sont prélevés sur le limbe des folioles contaminées et déposés au bain marie à 40°C pendant 20 minutes dans la solution 1, puis 1 heure à température ambiante dans la solution 2. Les disques sont ensuite montés entre lame et lamelle dans la solution 3 et observés au microscope à fluorescence avec filtre DAPI, à longueur d’onde d’excitation à 345 nm et à longueur d’onde d’émission à 455 nm.

Solution 1 :
o Bleu d’aniline
o Détergeant liquide pour vaisselle
o K3PO4 0,2 M
o NaOH 1 M

Solution 2 : Bleu d’aniline 1% dans K3PO4 0,1 M

Solution 3 : Bleu d’aniline 0,1% dans K3PO4 0,1 M

Comment marche cette technique de fluorescence? (quelle molécule est fluorescente, qu'est ce qu'un filtre DAPI et quel est l'intérêt de mettre le détergent, le K3PO4 et le NaOH dans la solution 1) par ce qu'en cherchant sur internet je trouve un peu tout et n'importe quoi

Quelqu'un pourrait-il m'aider svp ?
Merci d'avance
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[berzelius]

Bonjour,

1) le microscope à fluo: c'est un microscope tout ce qu'il y a de plus banal à deux exeptions près: il y a un filtre entre la source et l'échantillon pour choisir le lambda auquel on veut observer, puis un deuxième filtre entre l'échantillon et la caméra (ou l'oeil) pour sélectionner la longueur d'onde que l'on veut voir.

le fluorophore ici est le bleu d'anilline, il absorbe à 345nm donc le premier filtre ne laisse passer "que" des ondes à 345nm et fluoresce à 455nm. cette onde passe à travers le filtre 2 (le DAPI!) ce filtre premet de ne selectionner que ce que l'on veut voir et pas les "parasites" (le non spécifique).
le DAPI est un filtre pour le bleu -> voir google!

pour les autres composés: à quoi sert un détergent à la base?
c'est quoi le NaOH? et le K3PO4? une idée du pH final?
je laisse réfléchir et on en reparle plus tard ^^

[berzelius]

quand je dit le dapi je parle bien du filtre au fait, le "vrai" DAPI est un fluorophore!

[invite2039d1ce]

Merci beaucoup pour toute l'aide

Pour le détergent, je pensais éventuellement que ça pourrait solubiliser (et éliminer par la suite) les lipides de la cuticule de la foliole pour pouvoir observer plus facilement l'intérieur mais je n'en suis pas sure du tout et pareil pour le K3P04 (vu que c'est un émulsifiant).

Si c'est ça, je trouve ça un peu étonnant que la cuticule soit si gênante pour l'observation (et si c'est le cas pourquoi ne pas l'enlever directement à la pince avant de faire la coloration?)

Pour le NaOH, je ne vois toujours pas son rôle exact (cad quel est l'intérêt de travailler en milieu basique dans ce cas là ?) ou alors c'est encore pour solubiliser des lipides?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5f506739]

Bonjour,

J'ai déjà utilisé l'aniline bleu pour observé la callose d'un matériel végétal,
j'ai utilisé le K3PO4 pour solubilisé mon aniline bleu, (j'ai ensuite équilibré le pH à 11).

J'ai également utilisé le NaOH sur mon matériel végétal avant de faire cette coloration à l'aniline, car un traitement alcalin permet au tissu de devenir transparent (sinon, avec l'auto fluorescence de mon matériel, je ne pouvais pas voir le marquage).

J'espère que ceci t'aidera un peu à comprendre.

bon courage!