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ETUDE DE LA POLYPHENOL OXYDASE DE LA POMME;
La polyphénol oxydase (E.C. 1.14.18.1) catalyse la première étape du brunissement enzymatique qui transforme les composés phénoliques en produits quinoniques précurseurs des mélanines colorées.
L'acide chlorogénique et le catéchol présents dans de nombreux tissus végétaux sont des substrats de la polyphénol oxydase.
L'une des méthodes de dosage de l'activité polyphénol oxydase consiste à suivre au spectrophotomètre l'apparition des produits colorés.
1. Extraction de la polyphénol oxydase de la pomme
Peler une pomme, la découper en morceaux et en broyer 25 g avec 50 mL d'acétone glacée.
Transvaser dans un pot à centrifuger, rincer avec 30 mL d'acétone glacée. Centrifuger 10 minutes à 10 000 x g et à 4°C.
Eliminer le surnageant, ajouter 30 mL d'acétone glacée, mélanger puis centrifuger dans les mêmes conditions.
Eliminer le surnageant, sécher le culot sous courant d'azote.
Remettre le culot en suspension dans 50 mL de tampon acétate pH 5,6 ; 0,05 mol/L. Agiter 30 minutes à 4°C.
Centrifuger 10 minutes à 20 000 x g à 4°C.
Précipiter les protéines par addition d'acétone glacée (3 vol d'acétone pour 2 vol d'extrait). Agiter 2 minutes et laisser 1 h à 4°C.
Le précipité floconneux, récupéré par centrifugation à 10 000 g à 4°C constitue l'extrait enzymatique.
2. Cinétique
2.1. Réactifs et matériel
- extrait enzymatique,
- S = solution de catéchol 3.10-2 mol/L en tampon acétate 0,05 mol/L ; pH 5,6,
- T = tampon acétate 0,05 mol/L ; pH 5,6,
- Si = solution de catéchol 3.10-2 mol/L en tampon acétate 0,05 mol/L ; pH 5,6 + acide benzoïque 2.10-3 mol/L,
- Ti = tampon acétate 0,05 mol/L ; pH 5,6 + acide benzoïque 2.10-3 mol/L,
- spectrophotomètre avec cuve thermostatée.
2.2. Préparation des solutions de substrat
S1 S2 S3 S4 S5 S6
S (mL) 20 20 15 10 7,5 5
T (mL) 0 10 15 20 22,5 25
Si1 Si2 Si3 Si4 Si5 Si6
Si (mL) 20 20 15 10 7,5 5
Ti (mL) 0 10 15 20 22,5 25
2.3. Mesures
Les mesures sont réalisées à 30°C sur un mélange de 3 mL de substrat et 100 µL d'extrait. Les absorbances sont lues à 400 nm.
2.4. Détermination des caractéristiques cinétiques
Déterminer les vitesses initiales.
Calculer KM, VM et Ki.
Quel est l'effet de l'acide benzoïque ?
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Envoyé par chocapik 
