Bonjour,
n'ayant qu'une faible formation en biochimie et enzymologie, j'aimerai bien avoir de l'aide pour comment calculer une activité catalasique de la catalse, qui dismute le H2O2, de Saccharomyces cerevisiae. La mesure de l'activité a été effectuée par spectrophotométrie à une absorbance de 240nm sur une durée de 2min.
J'aimerai aussi savoir ce que signifie ɛ240= 39,4 M-1cm-1 ?!
Je vous remercie pour toute réponse.
Cordialement,
Genista
activité catalasique? ça existe ça? plutot activité catalytique non?
Il faut se servir de la loi de Beer Lambert A = C*ɛ*L
où avec la courbe spectrophotométrique, tu as déjà la cinétique de l'enzyme.
Ensuite, ɛ ou epsilon c'est le coeffiscient d'extinction molaire d'une entité chimique. C'est le rapport entre l'absorptivité et la concentration d'une entité chimique absorbante dans ce milieu.
Je te remercie pour ta réponse rapide Vil.
Par contre par rapport à la courbe tu pourrais détailler un peu ? ΔAbs240/2min ou /s ... ΔAbs240 étant ??
Ca se dit l'activité catalasique, et oui ça existe, pour différencier de l'activité peroxydasique.
C'est le fait de rajouter "de la catalase" après "activité catalasique" qui m'a perturber.
Bah avec ta courbe, tu as une A/t et donc avec la loi de Beer Lambert, tu as C = A/(epsilon*L) et donc tu obtiendra une concentration sur un temps (mol/s ou mol/min selon l'échelle) qui sera une vitesse enzymatique.
Pour avoir A/t, il suffit juste de calculer le coeffiscient directeur de la tangeantes que tu prends sur ta courbe qui reste linéaire (c'est là où ta vitesse sera maximum si le subtrat est apporté en excès et que l'enzyme est limitant)
Après, il faut s'aider de l'équation de Mickaelis pour finir de résoudre son soucis.
http://fr.wikipedia.org/wiki/Équatio...chaelis-Menten
(Vmax = K2*[ES] etc...)
Ah vue que la catalase n'est pas saturée par son substrat je ne pense que pas que je puisse avoir une Vmax !! C'est ce que j'ai lu quelque part mais je n'en suis pas sûre. j'y connais pas grand chose en enzymo.
Je ne pense pas non plus que je puisse appliquer la loi dont tu m'as parlé.
En fait là il me faut une activité en Katal,le truc c'est que j'ai trouvé qu'une mole de catalase dismute 40 millions de mole de substrat ou une molécule transforme 1million de molécules de H2O2 tout ça par seconde, quelle est la différence ?? J'avoue que je m'y perds !!
Merci encore une fois de ton aide.
(Excuses moi de me permettre de te tutoyer).
Aussi, là j'ai plutôt une courbe décroissante représentant la disparition du peroxyde d'hydrogène et non une droite. (Bref l'excel m'énerve aussi ... la technologie et moi ... bah !!)
En fait L c'est quoi ?? La longueur d'onde ??Envoyé par VilCrocrotte
Désolé de ne pas répondre aux questions mais je suis très occupé donc je répond aux questions faciles ^^
L c'est la longueur de la cuve que le rayon du spectro traverse
C'est normal, c'est la cinétique classique d'une activité. 3 parties :
- une au début qui est linéaire et proportionnel
- une qui n'est pas proportionnel et qui se courbe
- et une phase quasi plateau si on laisse suffisament longtemps mais c'est sur 30 min environ ça.
Sur 2 min, tu devrais obtenir une droite donc fait une régression linéaire et ça passera
Cette descente de courbe est dù à l'épuisement du substrat. On peut avoir l'inverse si on observe l'apparition d'un produit coloré.
Je te remercie . Tes explications m'aident beaucoup.
Je te souhaite de passer une bonne soirée. ^^
Salut,
J'ai trouvé cette formule pour un travail et des calculs similaires aux miens, est ce que je peux l'utiliser ? C'est pour un résultat de calcul d'une activité en "nkatal"
AE= ΔAbs x Vréactionnel x facteur de dilution x 109/Δt x ɛ x Venzyme
Bien sur !! Mais faites attention aux unités !!
1 katal = 1 mol de substrat transformé/s (donc nkat = 10^-9 mol/s)
Et cette formule vous donne bien sur une activité enzymatique exprimé en... je vous laisse essayer de le deviner avec les unités ^^
Merci pour la rapidité de la réponse Vil. ^^
Euh la formule me donne un résultat exprimé en katal ??Vu que la catalase dismute 40 millions de moles de H2O2 par seconde et que l'activité est mesurée sur 2 minutes !!
Mais je n'en suis pas sûre !!
Et en fait, le katal est toujours utilisé ou maintenant ce n'est que l'Unité Internationale (UI) ?
40 millions !!! WOUAOUH !!
Le katal comme l'UI sont toujours utilisés
Revoyer votre calcule car bon, 40 millions de moles par seconde, c'est un peu beaucoup ^^ (voir beaucoup beaucoup !ça ne doit meme pas dépasser les 300 si c'est en UI il me semble et selon les unités utilisées)
Il y a forcément une erreur dans votre calcul.
Etalez-le là et mettez à chaque fois les unités que vous avez utilsé pour chaque donnée en recopiant le petit truc que je vous ai fait en dessous.
ΔAbs :
Vréactionnel :
facteur de dilution
10^9/Δt
ɛ
Venzyme
40 millions, c'est ce que j'ai trouvé dans la littérature ou encore 10 millions (moles par seconde). Ou sinon j'ai trouvé aussi que pour la catalase, 300000 réactions se font par seconde !! Toute ces données m'ont rendu confuse.40 millions !!! WOUAOUH !!
Le katal comme l'UI sont toujours utilisés
Revoyer votre calcule car bon, 40 millions de moles par seconde, c'est un peu beaucoup ^^ (voir beaucoup beaucoup !ça ne doit meme pas dépasser les 300 si c'est en UI il me semble et selon les unités utilisées)
Il y a forcément une erreur dans votre calcul.
Etalez-le là et mettez à chaque fois les unités que vous avez utilsé pour chaque donnée en recopiant le petit truc que je vous ai fait en dessous.
ΔAbs :
Vréactionnel :
facteur de dilution
10^9/Δt
ɛ
Venzyme
Pour la catalase A que j'ai purifiée j'ai trouvé AE= 1. 109 (approximativement), après j'ai pensé que c'était en nkatal mais pas sûre !!
ΔAbs : 0,247
Vréactionnel : 1000 µl
facteur de dilution: 100
10^9
Δt: 60 sec
ɛ: 39,4 M-1 cm-1
Venzyme: 10 µl
Et j'ai fait la même chose pour la catalase commerciale que j'utilise comme témoin, dont j'ai trouvé AE= 4,1. 109
Voilà
Si c'est en nkatal, ça donne 1 katal donc une mole transformée par seconde et c'est rien du tout comparée à l'activité de la Cta1 !!!! Je me suis peut-être trompée dans les données utilisées pour les calculs !!
Oui, enfin, c'est à vérifier mais je pense qu'il y a une erreur quelque part.
Katal = mol/s
l'activité c'est normalement en mol/s/ug d'enzyme ou encore en mol/s/mL d'enzyme
Donc déjà, si tu mets tes volumes en litre (juste à rajouter x10^-6) bah tu vas te rendre compte que le litre de epsilon va se supprimer (donc pas de soucis pour ça) mais de 1, tu vas avoir un résultat bien différent et de 2, tu vas te retrouver avec des L.mol/s et ça, c'est pas bon !
Regarde, en reprenant ton calcul
AE= ΔAbs x Vréactionnel x facteur de dilution x 109/Δt x ɛ x Venzyme
Si on ne travail qu'avec les unité ça fait
(mol/s/mL enzyme) = (-) x (µL substrat) x (-) x (/s) x (mol/L/cm) x (µL enzyme)
Donc on voit bien qu'il y a une erreur quelques part ! N'êtes-vous pas d'accord?
1 µL = 10^-6 L ça permet de simplifier les unités sans faire d'erreur mais on voit que quand on regarde les unités, une fois simplifier on se retrouve avec un volume supplémentaire en hau! (le cm est supprimer avec A normalement)
Quand je fais le calcul juste en corrigeant les unités déjà, je trouve 1622 katal/L d'enzyme
Si je suis votre raisonnement, je trouve à la fin mol/s/L (si on fait abstraction du cm?!) mais pas du tout le même résultat ... !!
AE= 0.247 x 10-3L x 100 x 109 / 60sec x 39,4 L/mol. cm x 10. 10-6L = 1,045. 109 mais il y a un hic avec le "cm"
Après vous avez écrit que cm est supprimé avec A ... A ??
Sérieux, je n'ai jamais été aussi perdue de ma vie !! xD
A = absorbance ^^
En faite, cm c'est la longueur de la cuve qui est traversé et comme elle est toujours égale à 1... pas la peine d'en prendre compte.
On reprend tout car j'ai dit une bétise à cause de epislon...
ΔAbs : 0,247
Vréactionnel : 1000 µl = 10^3 x 10^-6 L = 10^-3 L
facteur de dilution: 100
10^9
Δt: 60 s
ɛ: 39,4 L/mol/cm
Venzyme: 10 µl = 10 x 10^-6 L = 10^-5 L
Donc en faite, le calcul est bon et cohérent c'était epsilon où je me suis trompé je n'avais pas pris en compte l'inverse. Donc sur le calcul ça fait
AE = 0,247 x 10^-3 x 10^2 x (1/60) x 10^9 x 39,4 x 10^-5
AE = 1,63 x 10^4 katal/L d'enzyme
PS : n'hésitez pas à mettre des parenthèses sur la calculatrice et n'oubliez pas de finir votre résultat sur une unité car je ne comprend rien a AE= 0.247 x 10-3L x 100 x 109 / 60sec x 39,4 L/mol. cm x 10. 10-6L = 1,045. 109 ????
1,045. 10^9 quoi??? il faut une unité !
Euh... vous ne voulez pas me donner la source de votre calcul? car encore une fois, au niveau des unités ça ne colle pas...
on multiplie des litres par des litres ça fait des litres² donc bon... tout ce que je viens de dire est faux...
Regardez la dernière feuille de ce PDF, je pense qu'il vous seras d'une plus grande utilité car on part sur de fausse route.
http://stlbioch.apinc.org/documents/..._zsp/b_zsp.pdf
http://forums.futura-sciences.com/bi...pecifique.html
Euh oui quand j'ai revue ça normalement ça donne mol/s. L
Sinon pour l'unité, c'est un des problèmes par rapport à mon résultat, je n'arrive pas à savoir quelle est la bonne unité.
Pour la source, c'est un rapport d'étudiants ... C'est pour cela que je voulais avoir un avis sur la formule.
http://www.tanguyaraud.com/doc/DEB-Rapport.pdf
Bah, pour les unités, on devez vous l'avoir appris ça.
A chaque fois que vous mettez une formule, vous mettez les unités au crayon de papier à coté et vous regarder ce qu'il se simplifie et ce qui s'amplifie.
Sinon, utiliser la formule qui est dans le pdf que je vous ai fourni car il est bien plus sur et cohérent au niveau des unités. Vous aurez des UI/L d'enzyme, il suffit juste de convertir en katal et le tour est jouer
deltaA/min c'est une vitesse initiale qui peut être calculer à partir de votre courbe (c'est juste le coeffiscient directeur de de votre droite)
Je vous remercie pour le lien ... Seulement, le volume total dont ils parlent, dans mon cas ça serait le volume de la fraction de purification ? Ou j'utilise le V (1ml) de la mesure ?
Normalement c'est celui de la mesure
Euh non pas du tout !! C'est ma première année ici en France, par rapport aux études que je fais maintenant, je dirai que j'ai eu une bien piètre formation !!
Là je ne vois pas du tout ce que ça veut dire ... Bref vous êtes tombé sur un cas ... !! xD
Ça peut être calculer à partir des données que j'ai ?? Je veux dire des valeurs d'Abs chaque deux secondes sur 2min ... Je peux calculer deltaAbs et la diviser sur deux minutes ?? Ou c'est trop facile ?!! (Un raisonnement de primaire ?! xD )
Enfin je ne désespère pas !! J'ai tout mon temps pour apprendre. ^^
Si vous ne me dites pas tout aussi... ^^ c'est vrai que le système pédagogique français peut paraitre dérisoire... mais certaines formations sont top !
Enfin, sinon, je vous ai expliqué une méthode au niveau des calculs. Vous vérifiez à chaque fois les formules en remplaçant les lettres par les unités et vous regardez si, quand les unités se simplifie, bah ça donne bien la bonne égalité.
Ensuite, par rapport à votre courbe du départ, vous avez mesuré une absorbance en fonction du temps donc si vous calculer le coeffiscient directeur de la droite, ça vous fait (A1-A2)/(T1-T2)=a
soit deltaA/deltaT (ou encore écrit DA/T)
delta c'est le signe grec pour dire la différence entre 2 choses hein ^^
Et ça, c'est votre vitesse de réaction enzymatique !
Ah ne vous méprenez pas !! Quand je dis que j'ai eu une piètre formation, je parlais de celle que j'ai eu dans mon pays. En ce moment, je suis bien contente de ce que j'apprends dans ma fac actuelle (Paris) même si c'est difficile.
En tout cas, vous m'avez été d'une très grande aide, compréhensif et très patient, pour l'inculte que je suis. ^^
Amicalement
Tout le plaisir est pour moi ^^
On fait de notre mieux pour vous aider (on = la communaité même si pas souvent présente à chaque fois)
Si vous voulez toujours de l'aide, n'hésitez pas, j'essayerai de vous aider une nouvelle fois.
Hum ... Bizarre ... J'ai trouvé 0,45. 10-6 UI/L ou 7,5. 10-6 nkatal/L si je me réfère à leur conversion !!
Je n'arrive pas à savoir si c'est juste.
