Plasmide

[invitefe123575]

Bonjour à tous,

j'étudie mon rapport de stage et il ya un truc que je ne comprend pas.
J'ai préparé des plasmides que j'ai inséré dans des cellules d'E.coli compétentes et ensuite je les extrait avec le kit Wizard Plus SV pour analyser le plasmide qui a été introduit dans les cellules(je ne comprends pas l'interet car normalement je sais ce que j'ai introduit alors pourquoi je les extrait?)
Ensuite, je fais une miniprep d'ADN plasmidique. et il ya cette phrase que je ne comprends pas "le plasmide est contrôlé par digestion et par PCR".
Si quelqu'un pouvait éclairer ma lanterne car je suis perdu!

merci
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[invitef5962f47]

Si tu as cloné ton insert dans ton plasmide, tu as obligatoirement une étape de transformation après la ligation pour sélectionner les plasmides qui se sont recircularisés. Apres tu sélectionnes certains clones puis minipreps pour récupérer les plasmides. Sinon on fait aussi des mini/midi/maxipreps pour faire des stocks de plasmides.

Pour vérifier que l'insert est bien présent, on peut faire une digestion pour savoir si les fragments migrent a la bonne taille, on peut faire une pcr pour savoir si on amplifie bien l'insert et on peut aussi séquencer ce qui permet en plus de vérifier qu'il n'y a pas de mutations dans l'insert.

[Edelweiss68]

Titre modifié, merci d'en choisir un explicite par la suite.

[invitefe123575]

Merci beaucoup de m'avoir répondu.mais j'ai d'autres questions qui me turlupinent.
Comment on sélectionne les plasmides recircularisés?j'ai compris pour la miniprep.
je ne comprends pas très bien ce que tu veux dire par la 'on peut faire une pcr pour savoir si on amplifie bien l'insert'.

dans mon rapport, il est indiqué que après la ligature, je fais une transformation des cellules d'E.colis compétentes et une fois les cellules transformés je lai extrait avec le kit wizard Plus SV.
Ensuite, je fais une miniprep : le plasmide est controlé par digestion et par pcr.
C'est ce que je ne comprends pas. quand on dit par digestion, on veut dire aussi par migration électrophorétique? Et pourquoi par pcr.ce que je sais c'est que ça permet d'amplifier, de faire des copies en grands nombres.
Et à la suite de la pcr, j'ai également fait une révélation sur gel d'agarose.

Je ne comprends pas très bien tout ce cheminement et il faut absolument que je comprenne car c'est pour le boulot.

Merci beaucoup à tous ceux qui voudront bien m'aider

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef5962f47]

Comment on sélectionne les plasmides recircularisés?j'ai compris pour la miniprep.

La selection des plasmides recircularisés se fait lors de la transformation de cellules électrocompétentes. Seules les cellules ayant "reçu" un plasmide recircularisé pourront croitre sur le milieu sélectif car seulement ces plasmides peuvent coder pour le gène de résistance en question (la sélection doit se faire sur Ampicilline je suppose ?)

C'est ce que je ne comprends pas. quand on dit par digestion, on veut dire aussi par migration électrophorétique? Et pourquoi par pcr.ce que je sais c'est que ça permet d'amplifier, de faire des copies en grands nombres.
Et à la suite de la pcr, j'ai également fait une révélation sur gel d'agarose.

L'intérêt de la digestion enzymatique est de vérifier si l'insert est bien présent, donc on digère puis on fait migrer sur gel d'agarose pour vérifier que les fragments de digestion (insert + backbone) migrent bien a la taille attendue.
La PCR ici donne la même information que la digestion enzymatique, ça permets de confirmer que l'insert est bien présent car il est amplifié. Apres on fait migrer sur gel d'agarose pour vérifier la taille de la séquence amplifié et voir si elle correspond bien a celle attendue.

[invitefe123575]

Merci beaucoup U.N. Owen,

je comprends mieux.
Le repiquage des bactéries transformées est fait sur gélose contenant de l'Erythromycine.
Par Backbone, je comprends le vecteur.peux tu me corriger si je me trompe?

Merci

[invitef5962f47]

Par Backbone, je comprends le vecteur.peux tu me corriger si je me trompe?

Oui, backbone est juste le terme anglais pour vecteur.