Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

[Biologiste16]

Salut à celui ou celle qui va lire mon message ^^

Quelle est l'histoire des colonies satellites sur milieu LB additionné d'ampiciline, comment pouvons nous interpréter un tel résultat ?

Pour mieux m'expliquer: j'ai réalisée une transformation d'un plasmide (contenant 3 gènes de résistances, parmi eux l'ampicilline) avec un insert cloné sur le gène de résistance à l'ampicilline dans DH5alpha donc en principe ce gène devient non fonctionnel. Et quand j'ai étalé cette solution dans un milieu LB+Amp il y a eu formation de colonies satellites ! Devrai-je déduire que c'est les cellules transformées qui forment des colonies satellites et que les petites colonies formées autour correspondent aux cellules non transformées qui portent la résistance à l’antibiotique ?
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[inviteeb43014d]

C'est tout simplement parce que tes bactéries résistances à l'amp secrètent une beta-lactamase dans le milieu. Y a donc des bactéries non résistantes qui poussent autour (colonies sat)

[zouchet]

Salut à tous
c'est claire que ces colonies satellites sont résistantes à l'Ampicilline donc non transformées. les bactéries transformées ne doivent pas pousser sur ce milieu qui est normalement un milieu sélectif. il faut choisir une autre méthode d’ensemencement, pour sélectionner les bactéries transformées.
bon courage.

[Yoyo]

Salut

tu es certains d'avoir compris l'expérience? ca n'a aucun sens de cloner un insert dans un gène de resistance à l'ampicilline qui sert justement à sélectionner les transformants.
L'explication de Seron est la bonne pour expliquer les colonies satelites.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[zouchet]

Oui je suis totalement d'accord avec toi.
La Beta-lactamase diffuse autour des colonies résistantes, et ça permet aux bactéries non résistantes de pousser sous forme de colonies satellites, ça arrive, mais ceci reste à vérifier.

[Biologiste16]

Oui c'est correcte maintenant ! j'ai compris que le but d'ensemencer ces cellules transformées dans le milieu LB+Amp est justement pour les sélectionner, parce que j'arrivais pas à trouver le rapport (milieu ampicilline/bactéries sensibles)!!! mais je vois que c'est un cas particulier pour l'ampicilline , puisqu'il a un pouvoir bactériostatique, les bactéries sensibles peuvent également pousser donc ici c'est les cellules satellites qui sont sensibles à l'ampiciline et qui portent la construction plasmidique.

Merci.

[inviteeb43014d]

Je pense que y a un problème dans ta manip. C'est pas du tout sur que les colonies satellites portent ton plasmide (elles peuvent ne rien porter du tout).

Si tu veux sélectionner les bactéries sensibles à l'amp, tu dois procéder comme ça : (donc pour rappel, tu cherches les bactéries amp sensibles, antibio 2 resistantes, antiobio 3 resistantes cad a dire portant le plasmide ou la résistance a l amp est altérée par un insert (mais les deux autres restent effectives)

Tu fais ta transfo sur l'antibio 2 ou 3 (tu as dis que tu avais 2 autres résistances sur ton plasmide qui ne doivent pas être altérées par ton insert). Ca veut dire que seul les bactéries portant le plasmide (transformées) seront sélectionnées.

Ensuite tu stries tes transformants sur 2 boites en parallèles (attention, tu dois utiliser le même tips par colonie pour les deux boites) :
LB amp : 1 2 3 4 5 6
LB antibio 2 : 1 2 3 4 5 6

Ensuite tu sélectionnes les clones qui pousseront pas sur LB amp mais qui pousseront sur antibio 2 (exemple : le clone 2 et 4)

Cordialement,

Seron

[zouchet]

salut
ton but est de sélectionner tes bactéries transformées n'est ce pas?
alors tu commence par étaler ton milieu, après la transformation, sur un milieu LB,(tu nommeras cette boite Boite 0) bien sur après avoir fais les dilutions nécessaires pour ne pas avoir un tapis bactérien; tu laisse pousser le temps nécessaire et tu prépare 3 autres boites 1: LB+Amp; 2: LB+Antibio 2; 3: LB+Antibio 3.
après t'imprimes la boite 0 sur les trois autres boites en utilisant un tissu de velours; tu laisse incuber le temps qu'il faut.
les colonies transformées sont celles qui poussent à la fois sur la boite 0 ; 2 et 3 et ne poussent pas sur la boite 1.
si vous avez un autre protocole, on peut le discuter.
A+

[inviteeb43014d]

Sans vouloir être contraire Zouchet, je pense que ta technique me semble plus longue que celle que je lui ai proposé (c'est a dire transfo sur antibio 2 ou 3) et puis repique sur amp (pour faire un test pousse / pousse pas)

Mais c'est peut-être parce que je suis pas fan des répliques velours

[Biologiste16]

Yeah ! c'est intelligent tout ça...Merci beaucoup Seron ^^
Pour confirmer le clone j'ai fait autrement, donc après avoir prélever les colonies satellites je les ai ensemencé dans LB liquide + antibio 2 et quand ça a poussé j'ai fait un transfert sur milieu liquide LB+Amp et ça n'a pas poussé, il me semble que c'est correcte de cette façon aussi !
Mais dis moi s'il te plait, tu veux dire quoi par "utiliser le même tips par colonie" ?

[inviteeb43014d]

N'utilise pas tes colonies satellites, si ça se trouve, elles n'ont aucun plasmide (tu perds ton temps car dans tes colonies si tu ne sélectionnes rien tu vas avoir 90% de non transformées, 9% de transformées avec le plasmide sans insert -cad refermé sur lui même-, et 1% avec ton insert). Autant dire que tu cherches une aiguille dans une botte de foin (en plus, ces chiffres sont tout à fait arbitraires, c'est pt bien pire

Utiliser le même tips par colonie cad :

Sur ta boite Antibio 2 (sur lequel tu as fait ta transfo), imagine que tu as 20 transformants. Ce que tu fais, c'est que tu les numérotes (par exemple tu en prend 10). Chaque colonie (= numéro) représente donc un background génétique. Ensuite tu prend un tip, tu prend la colonie 1 avec et tu fais d'abord une strie sur LB Amp puis sur une boite LB antibio2 (tu gardes le même tips, c'est a dire le même ensemenceur, c'est à dire les mêmes bactéries). Ensuite tu sélectionnes les bactéries qui poussent pas sur LB Amp mais qui pousse sur LB + antiobio 2

Ca doit donner ca

LB Amp : 1 2 3 4 5 6
LB Antibio2 : 1 2 3 4 5 6


(ca réprésente tes 2 boites)

Donc par exemple, les bons clones sont les clones 1, 4 et 6 car ce sont les seuls qui poussent sur antibio2 mais pas sur amp.

Cordialement,

Seron


Mise à jour : Pour les colonies sats qui poussent avec antbio2, si ca se trouve c'est un mélange de bactéries portant ou pas l'insert. La technique que je te propose est la plus simple et la plus correcte.

[zouchet]

salut
c'est très astucieux ce que tu as dis Seron, ça se voit que tu es specialiste, contrairement à moi qui est généraliste
Mais la question qui se pose: est ce que l'antibiotique 2 ne risque pas d’éliminer les bactéries avant leur transformation?
cordialement

[inviteeb43014d]

Non non pas du tout

Dans un transformation classique (que ce soit avec des cellules électrocompétentes ou avec des chemocompétentes), tu dois laisser 1h tes bactéries dans du LB liquide (le temps que les bactéries qui possèdent le plasmide puissent exprimer la protéine donnant la résistance). Ensuite, tu peux étaler ça sur une boite possédant 1 des antibio qui se trouve sur ton plasmide

Ps : Je pense que ce protocole est bon : http://www.google.com/url?sa=t&rct=j...xSKmn2cMGdP1xQ

[zouchet]

salut
merci beaucoup.

j’espère qu'on se retrouvera sur une autre discussion