Cytométrie en flux : discrimination, compensation, contrôle isotypique

[MonkeyFace]

Bonjour à tous !

Je sais que le sujet de la cytométrie apparait beaucoup dans la recherche sur ce forum mais je n'ai pas trouvé les réponses à mes questions :s

Dans le cadre d'un stage, j'ai du utiliser un cytomètre de flux Coulter Epics XL.
Moi même jeune étudiant, et mon maître de stage pas beaucoup plus avancé que moi en cytométrie, nous nous sommes référé au responsable de l'antique machine qui nous a aiguillé et au final a plus ou moins manipulé à notre place.
Je dois maintenant écrire mon rapport de stage décrivant la mise en place du protocole, et cela fait une bonne semaine que je parcours les forums, tuto et autres wiki pour comprendre le fonctionnement de tout ça.
J'ai donc bien compris ce qu'étaient la discrimination, la compensation et le contrôle isotypique, mais je ne comprend absolument pas la démarche pour avoir les graphiques que j'ai obtenus.

Difficile d'expliquer sans les-dits graphiques...
Lors des réglages pré-analytiques, je n'ai que des graphiques en nuage de point séparé en 4 parties par une ligne verticale et une horizontale, j'avais compris que c'était pour soustraire la fluorescence venant d'autres fluorochrome, donc la compensation, et j'ai bien vu d'où on partait sur le net mais concrêtement on a fait quoi ?
J'ai cru comprendre qu'on jouait avec le gain pour bien aligner les populations mais "aligner sur un graphique" n'est pas un terme très rigoureux, et ce n'est qu'une explication pratique, on a fait quoi en vrai ?

désolé si je m'exprime mal, c'est assez confus...
La discrimination et le contrôle isotypique par contre, je ne vois pas du tout où cela apparait sur mes schémas

Merci de votre aide !
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[MonkeyFace]

Up 123456789

[Guillaume69]

Je ne suis pas sûr de comprendre ta question.
Lors de la compensation, tu soustrais, pour un fluorophore donné, le signal qu'il renvoit dans les PMT auquel il n'est pas destiné, c'est à dire ceux qui détectent des longueurs d'ondes plus élevées. Ta question, c'est de savoir comment le logiciel soustrait-il le signal ?

Je n'en ai aucune idée.
Si quelqu'un le sait et qu'il répond, tant mieux mais à moins que tu sois futur ingénieur ou technicien de plateforme je pense que personne n'ira t'embêter sur la question. La réalisation de la compensation n'est pas quelque chose qui s'indique dans les matériels et méthodes d'un rapport de stage ou d'un papier.
L'important, c'est de savoir que tu l'as fait (et éventuellement d'indiquer que tu l'as fait si nécessaire) ; et quel est le principe.

Dans ton protocole, ce qui compte c'est de parler de l'isolation / préparation de tes cellules et du marquage.

[MonkeyFace]

Merci de ta réponse !
Alors, je précise, le gros problème de mon mémoire est qu'il portait à l'origine sur une comparaison de populations dans du sang de patients, mais qu'en 2 mois nous n'avons pu faire que 4 manipulations.
Avec mon maitre de stage on a donc décidé de porter le sujet sur la mise au point du protocole opératoire (autant dire que mon mémoire est passé de lisible à biologiquement inintéressant), ce qui n'a rien de mécanique mais porte beaucoup plus sur les conditions expérimentales que sur les rares résultats

Ma question n'est pas aussi pointue et mécanique que ça, c'est plutôt "en quoi le papier que le logiciel a imprimé témoigne-t-il des actions qu'il a fait ?"
Parce que comme tu dis l'important est que je l'ai faite cette compensation, mais mettre ma figure en disant 'vous voyez, c'est compensé" sans expliquer en quoi, ça risque de pas bien passer (et c'est pas très satisfaisant non plus)
Je reprend la compensation mais ça compte aussi pour les autres étapes.
Tout le reste, marquage cellulaire etc, c'est bien compris (c'est quand même mon mémoire xD) et donc bien expliqué, il ne me reste plus que cette partie à terminer

[A voir en vidéo sur Futura]

[MonkeyFace]

petit UP ^^

[MonkeyFace]

Autre UP ^^

[MonkeyFace]

UP encore ^^'

[MonkeyFace]

Euh... UP ?

[MonkeyFace]

Je garde espoir...

[MonkeyFace]

UP n°7 ^^ .

[Gordak]

Salut,

Ne te réjouis pas trop de cette réponse ! Mais vu que tu as l'air assez déséspéré je voulais juste te montrer ces animations.

ça m'étonnerait fort que cela puisse t'aider, mais vu que je n'ai pas beaucoup utilisé cette technique, je dois dire que je ne comprends pas vraiment à quel niveau se situe ton problème ... S'agit-il uniquement du processing de tes datas ou cela concerne-t-il aussi le règlage de ton appareil (qu'aurait fait si j'ai bien compris le responsable de ta machine) ?

[v_711]

Un conseil, joue un peu avec cet outil.

Tu devrais arriver à comprendre l'origine des compensations :
Quand on utilise plusieurs fluorophores, la lumière émise par certains peut "overlaper" dans le filtre d'un autre. Pire, cette même lumière peut dans certains cas une source d'excitation d'un second fluorophore.
Du coup, tu te retrouves avec des mesures de fluorescences plus élevées qu'en présence d'un unique anticorps.
Compenser, c'est corriger cette erreur.
Concrètement, on diminue la fluorescence lue d'un certain pourcentage pour chacun des fluorophores.
Et étant donné que l'intensité de fluorescence lue dépend (notamment) des valeurs des PMT, il faut redéfinir une matrice de compensation pour chaque expérience.