mutagènese, transformation, transfection

[invite6972518d]

bonjour tous le monde

j'avais effectué un stage sa fait plusieurs mois dans labo de recherche, est maintenant en reprenant mes note je m'aperçois que j'ai oublié beaucoup de chose et j'ai pas mal de question sans réponse: je vais écrire u petit résumé du travail, j'espère que quelqu’un pourra me corriger ou m'éclairer

donc l'objectif du travail est d'étudier des protéines qui interviennent dans la réparation des cassures double brin de l'ADN

- on realiser une mutagénése dirigé sur un vecteur bluescript et c'est ici que je bloque et que tous se mélange:
après mutagénése on a digéré le plasmide méthylé par DPN1 pour pouvoir transformer des bactéries compétentes, les bactéries transformé par le plasmides se développe sur milieu contenant de l'antibiotique
es que cette étape de transformation nous permet seulement de vérifier la transformation, ou bien on peut éventuellement extraire et purifier ces plasmides.
es que une étape de ligation est obligatoire après l'étape la digestion par le DPN1

-après la mutagènése dirigé on a effectuer une étape ou on a inséré l'ADN DU BLUESCRIPT vers un vecteur POZ,
cette étape la je n'arrive pas du tout a la positionner par rapport a ma transformation.

es que on a vérifiés la transformation par transfection puis on a transférés l'ADN du bluescript ver POZ ou bien le contraire????

sachant que l'objectif du travail est de transfécter des cellules eucaryotes par un vecteur d'expression pour étudier les fonction d'une protéine par western et immunofluorescence


excusez mois si mes questions sont un peu bête,mais je n'ai effectué qu'un stage de 15 jours ou j'ai pas pu tout retenir

merci d'avance pour vos réponses
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[Alhec]

Ue mutagenèse dirigée de quoi sur quoi? Sûrement pas sur le vecteur lui-même, puisque ce n'est qu'un vecteur.

Il faudrait déjà plus de précisions là, sinon c'est incompréhensible.

[invite6972518d]

une mutagènese sur un gène codant la protéine BAP1 qui est colé à une vecteur bluescript,
l'objectif est de générer plusieurs mutant pour pouvoir par la suite transfecter des cellules eucaryotes

[piwi]

Ce que je comprends c'est que vous avez fait une mutagénèse dirigée par PCR à partir d'un plasmide X. Pour éliminer le plasmide matrice X vous avez utilisé la spécificité de l'enzyme de restriction DpnI pour les sites méthylés. Ainsi, l'enzyme a digéré le plasmide matrice, produit en bactérie (donc méthylé) et pas le plasmide produit par PCR, non méthylé. C'est un premier point. DpnI est utilisé pour éliminer les plasmides matrices après une réaction de PCR.
L'étape de ligation va permettre de fermer vos plasmides amplifiés par PCR.
La suite est un peu plus floue, je reconstruit. Vous avez fait votre mutagénèse en bluescript (vecteur de clonage). Vous souhaitez exprimer votre insert dans des cellules de mammifères. Il vous faut donc un vecteur d'expression eucaryote. Du coup le transfert Bluescript ---> POZ est logique. Je ne comprends pas le sens de vos questions ici. Enfin, je ne pense pas m'être trompé sur ce que vous devez avoir fait et j'espère que mes explications sont suffisantes pour vous aider à vous y retrouver.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6972518d]

merci piwi

c exactement ca ce que on fait, le problème c'est que je n'arrive pas a situer le moment ou on a fait la transformation par rapport a notre transfert du bluescript vers POZ

donc ma question exacte: es que on fait la transformation des bactérie pour vérifier la mutagènése, puis on transfert le reste du mélange de mutagénèse du bluescript vers POZ. OU BIEN on transfert le bluescript vers poz directement après la mutagènése avant de transformer nos bactéries.

es que la transformation dans ce cas la nous sert uniquement pour vérifier la mutagènese, ou elle permet aussi d'amplifier le plasmid bluescript OU poz, qu'on poura purifier par la suite pour l'utilisé dans la transfection.

[Alhec]

Tu as 2 transformations distinctes en fait. Une première, avec les bactéries, qui te sert à amplifier le plasmide et réaliser la mutagenèse dirigée. Ensuite, tu récupère ton bluescript et tu transfert dans le vecteur POZ. Ensuite, tu transformes des cellules eucaryotes avec le vecteur POZ.

En tout cas, c'est comme ça que je le comprends.

[piwi]

Pour vérifier une mutagénèse sur un petit insert (d'un ordre de grandeur inférieur au 10Kb) le plus simple est de faire quelques restrictions et un séquençage. Vous n'avez pas fait de séquençage du Bluescript?

Cordialement,
piwi

[invite6972518d]

effectivement piwii, je crois bien qu'il y avait une étape de séquençage à faire (mais qu'on a pas réalisé en ma présence)

donc ce que j'ai compris, c'est qu'on peu récupérer les vecteur bluescript de nos bactéries transformées, les purifier puis les transférer sur des POZ es que c'est ca???

j'ai fait une recherche concernant le vecteur POZ mais je ne trouve rien, si vous avez plus d'info vous pouvez m'aider peut être

merci