Probleme sequençage = faible homologie

[ghotib]

Bonjour,

j'ai sous-cloné un gène d'intérêt dans des vecteurs bactériens (souche xl1-blue) mais après séquençage (société externe), mon taux d'homologie avec la séquence d'origine et parfois de 100%, 95% voir même 30%...

Comment peut-on avoir que 30% d'homologie ??? est la faute à la souche bactérienne qui à des soucis lors de la polymérisation ???

en général combien faut-il envoyer de clones au séquençage pour être sur d'avoir au moins une séquence avec 100% d'homologie par rapport à la séquence de départ?

merci d'avance pour vos réponses,

Cordialement
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[Svenn]

Bonjour,

j'ai sous-cloné un gène d'intérêt dans des vecteurs bactériens (souche xl1-blue) mais après séquençage (société externe), mon taux d'homologie avec la séquence d'origine et parfois de 100%, 95% voir même 30%...

Comment peut-on avoir que 30% d'homologie ??? est la faute à la souche bactérienne qui à des soucis lors de la polymérisation ???

en général combien faut-il envoyer de clones au séquençage pour être sur d'avoir au moins une séquence avec 100% d'homologie par rapport à la séquence de départ?

merci d'avance pour vos réponses,

Cordialement

Pour un gène "normal" (disons <5 à 10 kb) et si tu as travaillé avec une polymérase fidèle, tu amplifies trois clones, tu vérifies la présence de l'insert par PCR ou par digestion puis tu envoies un seul des clones positifs au séquençage et la plupart du temps il y aura zéro mutation. Si tu as seulement 30% d'identité de séquence, c'est sans doute que tu as pêché le mauvais gène. Il faut sans doute redesigner des primers plus spécifiques.

[ghotib]

Merci pour les éléments de réponse!

En général je teste effectivement 3 colonies par sous-clonage (digestion et présence d'insert) et j'en envoie qu'une seule en séquençage.

Pour ce qui est des primers, j'utilise tout le temps les mêmes...qui sont fournis par la société de séquençage...à savoir : primer T7.

Est ce que certains d'entre vous les ont déjà utilisés et rencontrer ce problème?

Merci d'avance!