Problème de séquençage

[Yoyo]

Bonsoir a tous,

Bon voila je suis confronté a des problemes avec le sequençage d'un plasmide.
Sur chacune des mes sequences, la réaction s'arrete de facon brutale (quelquesoit le brin que je séquence).
Je pense que c'est du a la présence d'une structure secondaire (un pseudonoeud) que j'ai mis dans mon insert, et qui bloque la polymerase durant le séquençage.

Ca m'ennuye car j'ai vraiment besoin de savoir si la séquence est bonne, et du coup il me manque toute la région du milieu!

J'aurai aimé savoir si certains ont été confronté a ce probleme et comment ils l'ont résolus?
d'un point de vue technique je séquence mon plasmide avec le kit 'bigDye" de chez applied biosystem sur un sequenceur ABI310.

J'avais pensé rajouter du DMSO, mais je sais pas si c'est utile et surtout si le kit va encore marcher... any idea?

Merci par avance
YOyo
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[invitead282ff2]

Salut,

peut etre peut digérer ton plasmide avec une enzyme de restriction en ciblant un site unique a proximité de la région "pseudonoeud" et effectuer deux séquencage s indépendants?

Morphine

[MaliciaR]

Hello,

Salut,

peut etre peut digérer ton plasmide avec une enzyme de restriction en ciblant un site unique a proximité de la région "pseudonoeud" et effectuer deux séquencage s indépendants?

Morphine

Je trouve cette idée très bonne Ou pourquoi pas carrément digérer au niveau du "pseudonoeud" lui-même, histoire de le défaire? Ou encore, couper des deux côtés, de manière à n'exciser que cet endroit problématique...?

Mais dis, Yoyo, tu as un moyen de vérifier que tu as bien affaire à ce "pseudonoeud"? C'est une structure type "tige-boucle" que tu as, est-ce cela?


Cordialement,

[Yoyo]

SAlut

l'idée n'est pas bete en effet couper dans le pseudonoeud et vérifier en séquencant chaque coté, merci!. Je vais aller voir si par hasard il n'y aurai pas un site de restriction... ca risque d'etre chaud.

Mais dis, Yoyo, tu as un moyen de vérifier que tu as bien affaire à ce "pseudonoeud"? C'est une structure type "tige-boucle" que tu as, est-ce cela?

ben oui en sequençant en fait ce sont deux tiges boucles entrelacées.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

SAlut

l'idée n'est pas bete en effet couper dans le pseudonoeud et vérifier en séquencant chaque coté, merci!. Je vais aller voir si par hasard il n'y aurai pas un site de restriction... ca risque d'etre chaud.

Chaud, non; acrobatique, peut-être
J'avais découvert la fonction "Silent sites" sous Strider (oui, il a de bons côtés, Strider, grmblgrmbl ). Si possible, tu introduis une mutation silencieuse par PCR au sein de ton "pseudonoeud" (la fonction "Silent sites" te donne justement l'endroit où tu peux le faire ). Et puis, tu coupes

ben oui en sequençant en fait ce sont deux tiges boucles entrelacées.

YOyo

Ha, des amoureux Comment t'as fait pour obtenir un truc pareil?


Cordialement,

[Yoyo]

Chaud, non; acrobatique, peut-être
J'avais découvert la fonction "Silent sites" sous Strider (oui, il a de bons côtés, Strider, grmblgrmbl ). Si possible, tu introduis une mutation silencieuse par PCR au sein de ton "pseudonoeud" (la fonction "Silent sites" te donne justement l'endroit où tu peux le faire ). Et puis, tu coupes

ben non je peux pas faire ca, car je veux pas modifier la sequence primaire de mon pseudonoeud

Ha, des amoureux Comment t'as fait pour obtenir un truc pareil?

J'ai commandé des oligos non blague a part, c'est pour etudier le role de cette structure dans la traduction...

YOyo

[MaliciaR]

ben non je peux pas faire ca, car je veux pas modifier la sequence primaire de mon pseudonoeud

Même si tu connais la modification introduite? Je veux dire, si la mutation est silencieuse, ça ne devrait pas trop poser problème, si? Surtout que si cette mutation est là, tu n'auras probablement pas de formation de "tige-boucle", du coup peut-être pas besoin de digérer. Et tu seras toujours gagnant dans le sens où tu sauras où précisément tu as introduit ta mutation, donc tu connaître la modification précise (Désolée si je raconte des âneries )

J'ai commandé des oligos non blague a part, c'est pour etudier le role de cette structure dans la traduction...

YOyo

C'est vrai qu'avec des oligos on peut faire des trucs pareils? Blague à part, tu fileras la référence du papier qui en sortira, ça sera intéressant


Cordialement,

P.S. Je ne suis pas du tout une pro du domaine Mais n'y a-t-il pas un autre moyen de défaire cette structure secondaire (enfin, ces deux structures secondaires ) avant de séquencer (chauffage, que sais-je,...)?

[Yoyo]

Même si tu connais la modification introduite? Je veux dire, si la mutation est silencieuse, ça ne devrait pas trop poser problème, si? Surtout que si cette mutation est là, tu n'auras probablement pas de formation de "tige-boucle", du coup peut-être pas besoin de digérer. Et tu seras toujours gagnant dans le sens où tu sauras où précisément tu as introduit ta mutation, donc tu connaître la modification précise (Désolée si je raconte des âneries )

ben non c'est pas possible! je ne veux pas modifier sa sequence! car c'est bien l'effet du pseudonoeud que je veux etudier, or cet effet se joue au niveau de l'ARN

C'est vrai qu'avec des oligos on peut faire des trucs pareils? Blague à part, tu fileras la référence du papier qui en sortira, ça sera intéressant

voila ce qui est deja sorti : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16688178

P.S. Je ne suis pas du tout une pro du domaine Mais n'y a-t-il pas un autre moyen de défaire cette structure secondaire (enfin, ces deux structures secondaires ) avant de séquencer (chauffage, que sais-je,...)?

j'ai trouvé que 5% de DMSO devait aider a ouvrir les structures secondaires lors du sequençage.

YOyo

[MaliciaR]

ben non c'est pas possible! je ne veux pas modifier sa sequence! car c'est bien l'effet du pseudonoeud que je veux etudier, or cet effet se joue au niveau de l'ARN

Gniii, je vois... Beh bon courage

voila ce qui est deja sorti : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16688178

Il me semble avoir aperçu cet article lors d'une recherche, oui Ceci dit, c'est cool les virus, hein?

Sérieusement : qu'est-ce que "a spring-like deformation of the P-site transfer RNA"?

j'ai trouvé que 5% de DMSO devait aider a ouvrir les structures secondaires lors du sequençage.

YOyo

C'est une bonne nouvelle. J'espère que ça marchera


Cordialement,

[gorben]

Salut,

L'elongation est bien a 60 deg C, c'est ca? Si c'est le cas, peut etre qu'en augmentant la temperature ca devrait passer (tu vas perdre de l'efficacite, mais de toute maniere, le DMSO aussi diminue l'efficacite).

Sinon (et c'est de tres tres loin ce que je ferais) tu peux envoyer ton plasmide a sequencer par une compagnie en leur expliquant le probleme. Ils ont enormements de differentes enzymes/mix/protocoles, et ce serait etrange qu'ils n'y arrivent pas... Ca coute ~20E les 800 pb

A+

[LXR]

En effet le DMSO c'est une bonne idée puisque tu vas diminuer la polarité de ton solvant. Ainsi tu défavorise la formation de liaisons hydrogènes responsables de la formation des structures secondaires te gênant pour ton séquençage. Sinon tu peux faire dans 100% huile de tournesol mais les AG saturés risquent fort de gêner la progression de la DNA polymérase.

Greg

[Yoyo]

Salut,

L'elongation est bien a 60 deg C, c'est ca? Si c'est le cas, peut etre qu'en augmentant la temperature ca devrait passer (tu vas perdre de l'efficacite, mais de toute maniere, le DMSO aussi diminue l'efficacite).

Merci du conseil, j'ai essayé avec du DMSO et comme je dispose d'une PCR a gradient je l'ai faite a 60, 65 et 70...sans savoir ce que tu ca a allais diminuer l'efficicacité c'est pas malin d'avoir combiné les deux

Sinon (et c'est de tres tres loin ce que je ferais) tu peux envoyer ton plasmide a sequencer par une compagnie en leur expliquant le probleme. Ils ont enormements de differentes enzymes/mix/protocoles, et ce serait etrange qu'ils n'y arrivent pas... Ca coute ~20E les 800 pb

A+

EN fait je me suis remis au sequençage car justement c'est les sequences que la société nous envoie qui présente ces problemes de sequence! Mais je ne pense pas qu'ils fassent la moindre optimisation en standard, je vais me renseigner car c'est une bonne idée.

Merci pour les AG, mais je crains aussi que la polymerase n'apprécie pas du tout... sans compter que ca va poser des problemes pour les étapes suivantes

YOyo

[Zellus]

Salut,

Je ne suis vraiment pas un pro du séquençage mais je me demandais si tu ne pouvais pas chauffer ton ADN à 95°C (comme pour une PCR) et rajouter ensuite ton enzyme ... Mais peut-être qu'après le pseudonoeud se reforme trop rapidement ...

[gorben]

EN fait je me suis remis au sequençage car justement c'est les sequences que la société nous envoie qui présente ces problemes de sequence! Mais je ne pense pas qu'ils fassent la moindre optimisation en standard, je vais me renseigner car c'est une bonne idée.

En fait le truc c'est qu'il faut leur expliquer le probleme. Pendant longtemps j'avais recu des sequences pourrie jusqu'au jour ou je leur ai dis que mon organisme etait "low GC%". Suite a ca il ont adapte le protocole, et j'ai toujours eu des sequences parfaites.

A+

[Yoyo]

Salut

bon alors meme avec 5% de DMSO ma sequence est pourrie
et a plus haute temperature 65 ou 70 c'est encore pire...

YOyo

[LXR]

Il faut avouer aussi qu'il faut être un peu allumé pour travailler sur une structure nucléotidique que le commun des biologistes cellulaires et moléculaires évitent comme la peste!! Mieux vaut toi que moi, mais apparemment le jeu en vaut la chandelle (Nature...).

Greg

[MaliciaR]

Salut

bon alors meme avec 5% de DMSO ma sequence est pourrie
et a plus haute temperature 65 ou 70 c'est encore pire...

YOyo

Bon... Digère-les alors Ca peut pas être pire... Si...?

Il faut avouer aussi qu'il faut être un peu allumé pour travailler sur une structure nucléotidique que le commun des biologistes cellulaires et moléculaires évitent comme la peste!! Mieux vaut toi que moi, mais apparemment le jeu en vaut la chandelle (Nature...).

Greg

Mais c'est marrant Et puis, il en faut pour tous les goûts


Cordialement,

[Zellus]

Salut,

Et ça peut marcher mon idée de chauffer avant juste par curiosité ?
Merci.

[invitead282ff2]

Il semblerait que "mon" idée soit la seule alternative encore en course...

En espérant que ca fonctionnera.

[Yoyo]

Salut,

Et ça peut marcher mon idée de chauffer avant juste par curiosité ?
Merci.

Non car mon probleme se situe au niveau de l'elongation, la structure secondaire se forme et ne permet pas a la taq de passer!... donc meme en dénaturant elle se reformerait lors de l'annealing.

Il semblerait que "mon" idée soit la seule alternative encore en course...

En espérant que ca fonctionnera.

j'ai regardé mais ca aurait été trop beau il n'y a aucun site de restriction utilisable!

C'est vrai que c'est passionant l'étude de ces structures, et puis ca donne de belles publis

Yoyo

[MaliciaR]

Bon...

Puisque la digestion n'est pas possible, tu ne peux pas "soniquer"? Je veux dire, provoquer un petit degré de fragmentation et puis tu séquences les bouts...? (Là, j'avoue, j'avance des trucs sans trop connaître ).


Cordialement,

[Zellus]

Et en ajoutant un dénaturant de l'ADN genre éthidium ce serait pas possible ?

[Yoyo]

Et en ajoutant un dénaturant de l'ADN genre éthidium ce serait pas possible ?

salut

le DMSO etait censé dénaturer l'ADN donc la structure secondaire. Le probleme il faut quand meme que l'enzyme fonctionne pour que le séquençage ait lieu.

Pour malicia je ne pense pas qu'on puisse soniquer l'ADN pour le sequencer.

YOyo

[Zellus]

C'est pour ça que je proposais un dénaturant type intercalant qui va dénaturer l'ADN et pas (?) la protéine. Le DMSO lui dénature les 2 donc c'est génant ...
Il vaut mieux augmenter la quantité d'enzyme cela dit.

PS : Je me demande depuis un moment si ton nom vient de l'intercalant qui s'appelle YOYO aussi ?

[gorben]

Dommage pour le DMSO et la temeperature

Et en prenant une amorce directement a l'interieur de ta structure (plutot que sur le plasmide) pour partir en sens oppose ca donne rien?

Sinon, en utilisant l'ABI tu as possibilite de faire du SSCP... c'est pas de la sequence, mais generalement c'est bien fiable, surtout si tu peux comparer / a une sequence que tu sais wt.

A+

[piwi]

Je n'ai peut être pas suivis toute l'histoire mais il y a une chose que je ne comprends pas.
Ce que tu séquences c'est bien le plasmide? Parce que je ne comprends pas survenue de structure secondaire dans de l'ADN double brin.

Cordialement,
piwi

[Yoyo]

Je n'ai peut être pas suivis toute l'histoire mais il y a une chose que je ne comprends pas.
Ce que tu séquences c'est bien le plasmide? Parce que je ne comprends pas survenue de structure secondaire dans de l'ADN double brin.

Cordialement,
piwi

Oui enfin un partie d'un plasmide, mais lorsque tu le séquences tu le dénatures pour permettre l'hybridation de ton amorce, il est alors sous forme simple brin ton ADN (au moins sur une partie) et c'est a ce moment la que la structure doit se former.

J'ai lu bcp de troobleshooting il conseille tous du DMSO ou de la betaine.. ou d'utiliser des dGTP au lieu des dITP habituellement utilisé... bref ca n'a pas l'air d'etre simple!

YOyo

[piwi]

Effectivement le problème peut se poser lors de l'hybridation. Tu pourrais essayer de travailler à la main en jouant sur la stringence non? Parce qu'avec tes deux boucles intriquées tu ne dois pas rentrer dans les clous d'une automatisation. Ton problème appelle une mise au point en profondeur à mon avis; pas juste un bricolage pour tenter de sauver les meubles

[jmbowie]

Bonsoir a tous,

Bon voila je suis confronté a des problemes avec le sequençage d'un plasmide.
Sur chacune des mes sequences, la réaction s'arrete de facon brutale (quelquesoit le brin que je séquence).
Je pense que c'est du a la présence d'une structure secondaire (un pseudonoeud) que j'ai mis dans mon insert, et qui bloque la polymerase durant le séquençage.

Ca m'ennuye car j'ai vraiment besoin de savoir si la séquence est bonne, et du coup il me manque toute la région du milieu!

J'aurai aimé savoir si certains ont été confronté a ce probleme et comment ils l'ont résolus?
d'un point de vue technique je séquence mon plasmide avec le kit 'bigDye" de chez applied biosystem sur un sequenceur ABI310.

J'avais pensé rajouter du DMSO, mais je sais pas si c'est utile et surtout si le kit va encore marcher... any idea?

Merci par avance
YOyo

Je n'ai pas lu toutes les réponses...ceci m'est déjà arrivé plusieurs fois et typiquement, cela est du à un mauvais ration quantité d'ADN matrice/quantité d'amorce.
Dans la notice du Big Dye, les ratios idéales sont précisés. Pour info, mes séquences fonctionnent bien en utilisant 3microL de BigDye, 2microL de Tampon, environ 1,5MicroG d'ADN pl et 4pMoles d'amorces.

Tu peux aussi augmenter le nombre de cycles dans ta réaction de séquences, avec le risque d'augmenter aussi le bruit de fond.

Enfin, il y a parfois des petites séquences que les polymérases n'aiment pas (petites répétitions, etc.)
Bon courage en tout cas, hésite pas à nous montrer tes "pics" qu'on voit cela.
A plus

[Zellus]

Bonsoir,

Juste une idée comme ça.
Je ne sais pas exactement comment se passe le séquençage en pratique (températures utilisées ...).
Il y a des cycles comme la PCR ?
Si c'est le cas, est-ce que tu ne pourrais pas diminuer le temps d'hybridation pour limiter la reformation de ton pseudonoeud ?