Problème de séquençage

[Yoyo]

Bonsoir a tous,

Bon voila je suis confronté a des problemes avec le sequençage d'un plasmide.
Sur chacune des mes sequences, la réaction s'arrete de facon brutale (quelquesoit le brin que je séquence).
Je pense que c'est du a la présence d'une structure secondaire (un pseudonoeud) que j'ai mis dans mon insert, et qui bloque la polymerase durant le séquençage.

Ca m'ennuye car j'ai vraiment besoin de savoir si la séquence est bonne, et du coup il me manque toute la région du milieu!

J'aurai aimé savoir si certains ont été confronté a ce probleme et comment ils l'ont résolus?
d'un point de vue technique je séquence mon plasmide avec le kit 'bigDye" de chez applied biosystem sur un sequenceur ABI310.

J'avais pensé rajouter du DMSO, mais je sais pas si c'est utile et surtout si le kit va encore marcher... any idea?

Merci par avance
YOyo

[Morphine]

Salut,

peut etre peut digérer ton plasmide avec une enzyme de restriction en ciblant un site unique a proximité de la région "pseudonoeud" et effectuer deux séquencage s indépendants?

Morphine

[MaliciaR]

Hello,

Salut,

peut etre peut digérer ton plasmide avec une enzyme de restriction en ciblant un site unique a proximité de la région "pseudonoeud" et effectuer deux séquencage s indépendants?

Morphine

Je trouve cette idée très bonne Ou pourquoi pas carrément digérer au niveau du "pseudonoeud" lui-même, histoire de le défaire? Ou encore, couper des deux côtés, de manière à n'exciser que cet endroit problématique...?

Mais dis, Yoyo, tu as un moyen de vérifier que tu as bien affaire à ce "pseudonoeud"? C'est une structure type "tige-boucle" que tu as, est-ce cela?


Cordialement,

[Yoyo]

SAlut

l'idée n'est pas bete en effet couper dans le pseudonoeud et vérifier en séquencant chaque coté, merci!. Je vais aller voir si par hasard il n'y aurai pas un site de restriction... ca risque d'etre chaud.

Mais dis, Yoyo, tu as un moyen de vérifier que tu as bien affaire à ce "pseudonoeud"? C'est une structure type "tige-boucle" que tu as, est-ce cela?

ben oui en sequençant en fait ce sont deux tiges boucles entrelacées.

YOyo

[MaliciaR]

SAlut

l'idée n'est pas bete en effet couper dans le pseudonoeud et vérifier en séquencant chaque coté, merci!. Je vais aller voir si par hasard il n'y aurai pas un site de restriction... ca risque d'etre chaud.

Chaud, non; acrobatique, peut-être
J'avais découvert la fonction "Silent sites" sous Strider (oui, il a de bons côtés, Strider, grmblgrmbl ). Si possible, tu introduis une mutation silencieuse par PCR au sein de ton "pseudonoeud" (la fonction "Silent sites" te donne justement l'endroit où tu peux le faire ). Et puis, tu coupes

ben oui en sequençant en fait ce sont deux tiges boucles entrelacées.

YOyo

Ha, des amoureux Comment t'as fait pour obtenir un truc pareil?


Cordialement,

[Yoyo]

Chaud, non; acrobatique, peut-être
J'avais découvert la fonction "Silent sites" sous Strider (oui, il a de bons côtés, Strider, grmblgrmbl ). Si possible, tu introduis une mutation silencieuse par PCR au sein de ton "pseudonoeud" (la fonction "Silent sites" te donne justement l'endroit où tu peux le faire ). Et puis, tu coupes

ben non je peux pas faire ca, car je veux pas modifier la sequence primaire de mon pseudonoeud

Ha, des amoureux Comment t'as fait pour obtenir un truc pareil?

J'ai commandé des oligos non blague a part, c'est pour etudier le role de cette structure dans la traduction...

YOyo

[MaliciaR]

ben non je peux pas faire ca, car je veux pas modifier la sequence primaire de mon pseudonoeud

Même si tu connais la modification introduite? Je veux dire, si la mutation est silencieuse, ça ne devrait pas trop poser problème, si? Surtout que si cette mutation est là, tu n'auras probablement pas de formation de "tige-boucle", du coup peut-être pas besoin de digérer. Et tu seras toujours gagnant dans le sens où tu sauras où précisément tu as introduit ta mutation, donc tu connaître la modification précise (Désolée si je raconte des âneries )

J'ai commandé des oligos non blague a part, c'est pour etudier le role de cette structure dans la traduction...

YOyo

C'est vrai qu'avec des oligos on peut faire des trucs pareils? Blague à part, tu fileras la référence du papier qui en sortira, ça sera intéressant


Cordialement,

P.S. Je ne suis pas du tout une pro du domaine Mais n'y a-t-il pas un autre moyen de défaire cette structure secondaire (enfin, ces deux structures secondaires ) avant de séquencer (chauffage, que sais-je,...)?

[Yoyo]

Même si tu connais la modification introduite? Je veux dire, si la mutation est silencieuse, ça ne devrait pas trop poser problème, si? Surtout que si cette mutation est là, tu n'auras probablement pas de formation de "tige-boucle", du coup peut-être pas besoin de digérer. Et tu seras toujours gagnant dans le sens où tu sauras où précisément tu as introduit ta mutation, donc tu connaître la modification précise (Désolée si je raconte des âneries )

ben non c'est pas possible! je ne veux pas modifier sa sequence! car c'est bien l'effet du pseudonoeud que je veux etudier, or cet effet se joue au niveau de l'ARN

C'est vrai qu'avec des oligos on peut faire des trucs pareils? Blague à part, tu fileras la référence du papier qui en sortira, ça sera intéressant

voila ce qui est deja sorti : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16688178

P.S. Je ne suis pas du tout une pro du domaine Mais n'y a-t-il pas un autre moyen de défaire cette structure secondaire (enfin, ces deux structures secondaires ) avant de séquencer (chauffage, que sais-je,...)?

j'ai trouvé que 5% de DMSO devait aider a ouvrir les structures secondaires lors du sequençage.

YOyo

[MaliciaR]

ben non c'est pas possible! je ne veux pas modifier sa sequence! car c'est bien l'effet du pseudonoeud que je veux etudier, or cet effet se joue au niveau de l'ARN

Gniii, je vois... Beh bon courage

voila ce qui est deja sorti : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16688178

Il me semble avoir aperçu cet article lors d'une recherche, oui Ceci dit, c'est cool les virus, hein?

Sérieusement : qu'est-ce que "a spring-like deformation of the P-site transfer RNA"?

j'ai trouvé que 5% de DMSO devait aider a ouvrir les structures secondaires lors du sequençage.

YOyo

C'est une bonne nouvelle. J'espère que ça marchera


Cordialement,

[gorben]

Salut,

L'elongation est bien a 60 deg C, c'est ca? Si c'est le cas, peut etre qu'en augmentant la temperature ca devrait passer (tu vas perdre de l'efficacite, mais de toute maniere, le DMSO aussi diminue l'efficacite).

Sinon (et c'est de tres tres loin ce que je ferais) tu peux envoyer ton plasmide a sequencer par une compagnie en leur expliquant le probleme. Ils ont enormements de differentes enzymes/mix/protocoles, et ce serait etrange qu'ils n'y arrivent pas... Ca coute ~20E les 800 pb

A+

[LXR]

En effet le DMSO c'est une bonne idée puisque tu vas diminuer la polarité de ton solvant. Ainsi tu défavorise la formation de liaisons hydrogènes responsables de la formation des structures secondaires te gênant pour ton séquençage. Sinon tu peux faire dans 100% huile de tournesol mais les AG saturés risquent fort de gêner la progression de la DNA polymérase.

Greg

[Yoyo]

Salut,

L'elongation est bien a 60 deg C, c'est ca? Si c'est le cas, peut etre qu'en augmentant la temperature ca devrait passer (tu vas perdre de l'efficacite, mais de toute maniere, le DMSO aussi diminue l'efficacite).

Merci du conseil, j'ai essayé avec du DMSO et comme je dispose d'une PCR a gradient je l'ai faite a 60, 65 et 70...sans savoir ce que tu ca a allais diminuer l'efficicacité c'est pas malin d'avoir combiné les deux

Sinon (et c'est de tres tres loin ce que je ferais) tu peux envoyer ton plasmide a sequencer par une compagnie en leur expliquant le probleme. Ils ont enormements de differentes enzymes/mix/protocoles, et ce serait etrange qu'ils n'y arrivent pas... Ca coute ~20E les 800 pb

A+

EN fait je me suis remis au sequençage car justement c'est les sequences que la société nous envoie qui présente ces problemes de sequence! Mais je ne pense pas qu'ils fassent la moindre optimisation en standard, je vais me renseigner car c'est une bonne idée.

Merci pour les AG, mais je crains aussi que la polymerase n'apprécie pas du tout... sans compter que ca va poser des problemes pour les étapes suivantes

YOyo

[Zellus]

Salut,

Je ne suis vraiment pas un pro du séquençage mais je me demandais si tu ne pouvais pas chauffer ton ADN à 95°C (comme pour une PCR) et rajouter ensuite ton enzyme ... Mais peut-être qu'après le pseudonoeud se reforme trop rapidement ...

[gorben]

EN fait je me suis remis au sequençage car justement c'est les sequences que la société nous envoie qui présente ces problemes de sequence! Mais je ne pense pas qu'ils fassent la moindre optimisation en standard, je vais me renseigner car c'est une bonne idée.

En fait le truc c'est qu'il faut leur expliquer le probleme. Pendant longtemps j'avais recu des sequences pourrie jusqu'au jour ou je leur ai dis que mon organisme etait "low GC%". Suite a ca il ont adapte le protocole, et j'ai toujours eu des sequences parfaites.

A+

[Yoyo]

Salut

bon alors meme avec 5% de DMSO ma sequence est pourrie
et a plus haute temperature 65 ou 70 c'est encore pire...

YOyo