clonage

[aminabio]

Bonjour, je voudrais savoir a quoi sert le clonage dans des bactéries compétentes le produit de PCR.
but de l'expérience c'est de mettre en devance une mutation dirigé par les TALENs
Merci
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[jmbowie]

La PCR et la transformation sont des étapes du clonage que tu devrais revoir.

[aminabio]

Merci pour votre réponse mais pour moi la PCR c'est pour l'amplification et apres une migration sur gel agarose suffit pour la séparation
donc svp je voudrais savoir le but du clonage et comment ça se fait

[jmbowie]

Le clonage sert à placer une séquence d'intérêt dans un contexte génétique bien contrôlé, le vecteur. Je suppose que l'idée est de voir ce qu'il y a avant un "traitement", ou une exposition aux protéines TALEN et après afin de caractériser la mutagénèse.
Pour les étapes, voir un cours

[A voir en vidéo sur Futura]

[aminabio]

donc je suis vraiment dzl de vs déranger mais je veux juste savoir prk passé par le clonage dans des bactéries alors que le le produit de PCR va être déjà amplifié avec des amorces spécifiques du gène d’intérêt ciblé par les TALEN , un gel d'agarose suffit d’après mon raisonnement.
après mon mettre de stage veut faire un clonage dans des bactéries je ne comprend po ou est l’intérêt du clonage

[jmbowie]

J'imagine que la mutagénèse par cette technique des TALENs (c'est un produit commercial, regarde sa notice) se fait in vivo donc en utilisant la machinerie de la bactérie (ou d'un autre organisme), le clonage du produit de PCR dans le vecteur permet de travailler avec le produit in vivo

[aminabio]

Merci bcp pour tte vos reponses pour le clonage oui peut être au piire je v essayer de trouver le courage de lui demander derectment encor merci

[aminabio]

Svp, je veux juste savoir si le clonage pourrai être utilisé afin de séparer des gènes (mettre en evidence le gene cible des talen) et non pas que pour l'amplification ou pas ?
Merci

[jmbowie]

Oui facilement si les gènes à différencier sont de tailles distinctes. Possible mais plus délicat s'il s'agit de mutations/substitutions, dans ce cas c'est en clonant le produit qu'on verra mieux la séquence

[aminabio]

d’accord c'est ce point qui me perturbé un peu pour les mutation on s'attend a des délétions de plus de 17pb donc normalement en clonant le gène lui même on pourrait mettre en évidence la mutation ou du moins identifier le gène ayant subit une modification.
par contre je voudrais aussi savoir si les étapes sont les suivantes:
- PCR avec amorces spécifiques de la séquence cible du gène d’intérêt
- clonage de produit de PCR: insertion dans un vecteur d'expression, transfection dans des bactéries contrepentes ,
sélection des clones ayant bien reçu le vecteur avec l'insert: grâce a un gène de résistance a un antibiotique et un gène rapporteur car le site d’insertion de l’insert est situé à l’intérieur du gène de la B-galactosidase
je sais que je demande un peu trop mais je n'arrive po imaginé comment tt ca va ns permettre de séparer le gène muté