marqueurs de sélection

[Kyle_XY]

Bonjour à tous , je ne suis pas sur de comprendre ceci :
- marqueurs de sélection
Aucune méthode de transformation n’est efficace à 100%. La proportion de cellules transformées dépasse en effet rarement 1‰. Pour sélectionner les cellules transformées, le fragment d’ADN utilisé doit contenir un gène conférant à ces cellules un avantage sélectif dans certaines conditions de culture. Ce gène est appelé marqueur de sélection. Deux types de marquer de sélection sont utilisés chez les levures : des gènes permettant de complémenter une mutation auxotrophique ou des gènes conférant la résistance à un antibiotique ou à un agent toxique.

- Complémentation d’une auxotrophie
Dans cette approche, il est nécessaire d’utiliser une souche de levure mutée au niveau d’un gène codant pour une enzyme impliquée dans la synthèse d’un métabolite essentiel. Cette levure est maintenue en vie en lui fournissant ce métabolite dans le milieu de culture. Si elle est placée sur un milieu dépourvu de cette molécule, elle meurt. Mais elle survivra sur ce même milieu si elle a reçu par transformation une copie intacte de ce gène. Ainsi le gène URA3 est fréquemment utilisé. Il code pour une enzyme catalysant la transformation d’orotidine-5’-phosphate en uridine monophosphate (UMP). Cette réaction fait partie d’une voie métabolique produisant uridine triphosphate (UTP) et cytidine triphosphate
(CTP). Les mutants ura3- ne peuvent survivre qu’en présence d’uracile dans le milieu de culture . Si ces mutants acquièrent un fragment d’ADN comportant le gène URA3 non muté, elle deviennent capables de croître sur un milieu dépourvu d’uracile.

- premièrement je ne comprends pas comment le marqueur permet de se rendre compte que le fragment d'ADN qu'onn a voulu inséré dans l'hôte a bel et bien été inseré ?
deuxièment , si il faut que la cellule hote soit mutée et qu'il faut utilisé un marqueur pour détecter qu'elle a une mutation et qu'elle a bien recu le fragment d'ADN puisqu'elle continue a vivre , celà veut dire qu'on ne peut pas inséré n'importe quel gène d'interet à une cellule hote ?
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[noir_ecaille]

1) premièrement je ne comprends pas comment le marqueur permet de se rendre compte que le fragment d'ADN qu'onn a voulu inséré dans l'hôte a bel et bien été inseré ?
2) deuxièment , si il faut que la cellule hote soit mutée et qu'il faut utilisé un marqueur pour détecter qu'elle a une mutation et qu'elle a bien recu le fragment d'ADN puisqu'elle continue a vivre , celà veut dire qu'on ne peut pas inséré n'importe quel gène d'interet à une cellule hote ?

1) Le "marqueur" sert tout simplement à la cellule à survivre dans un milieu sélectif -- soit la cellule possède le plasmide comportant le gène ou locus qui lui fait défaut pour pouvoir survivre sur ce milieu ; soit elle ne l'a pas, ce qui la condamne à plus ou moins brève échéance en plus d'empêcher sa croissance. Moralité : seule les cellules transformées (possédant le plasmide) présentent une croissance dans le milieu de culture sélectif (en l'absence normale de contaminant ).

2) Il faut tout de même que le marqueur obéisse à quelques règles :
- permettre la croissance sur un milieu sélectif pour les cellules transformées
- empêcher la croissance sur un milieu sélectif des cellule non transformées

Sans ces deux règles, on risque de retrouver les 99% de cellules non transformées en pleine forme, et peu de choper les 1% transformées qui nous intéressent.

Si par exemple le marqueur était la production d'un pigment, il n'est même pas certains d'avoir assez de bactérie pour obtenir des colonies de la couleur adéquates si les 1% transformées de l’inoculat sont inhibées par chimiotactisme -- auquel cas après croissance on peut très bien tomber à 0,1% ou même 0,001% de cellules transformées au sein de notre culture résultante.

[Kyle_XY]

soit la cellule possède le plasmide comportant le gène ou locus qui lui fait défaut pour pouvoir survivre sur ce milieu ; soit elle ne l'a pas, ce qui la condamne à plus ou moins brève échéance en plus d'empêcher sa croissance.

ce gène dont vous parlez est compris dans la séquence qu'on a injecté à la levure ? je veux dire la séquence qui codent pour le gène d'intérêt ? merci.

[Loupsio]

Bonjour
Le gène d'intérêt est inséré dans un plasmide, c'est ce plasmide qui contient le gène qui permet a la bactérie de survivre dans le milieu de selection

[A voir en vidéo sur Futura]

[Kyle_XY]

mais le gène d'intérêt ce n'est pas le gène qu'on veut obtenir en grande quantité ? Je pensais que dans ce fragment qu'on insérait il y aura ce qui code pour la protéine qu'on veut et puis un fragment de gène impliqué dans la reconnaissance avec le marqueur.. ce n'est pas le cas alors ?

[Loupsio]

non tu insère ton gène dans un plasmide qui contient la resistance a la selection (bien souvent un gène de resistance a un antibiotique)
si la bactérie survit dans une culture en présence de l'antibiotique, c'est qu'elle a en elle le plasmide