Bonjour,
Je m'exerce à comprendre comment faire une carte de restriction d'un plasmide :
Un plasmide a été ouvert avec BamHI (en un seul site) pour y insérer un gène d'intérêt. Le plasmide a été digéré de différentes manières avec B: BamHI, E:EcoRI et H:Hind III. (le gel est en pièce jointe).
J'ai commencé avec BamHI puisqu'il détermine le gène d'intérêt, sur le gel on voit deux bandes donc deux fragments, un de 3000pb (gène d'intérêt) et l'autre de 9000pb (le vecteur). L'échelle n'est pas très précise donc j'ai fixé la taille du plasmide + insert à 12000pb.
Après j'ai regardé B+E: on remarque que les bandes de E et de B seules sont équivaut à B+E du coup je me suis dit que les sites de restrictions sont consécutifs, j'ai donc inséré EcoRI après le 2e site de B (en lisant dans le sens horaire) et l'autre E à 1300pb du 1er E (toujours en lisant dans le sens horaire) ce qui donne la seconde image.
Finalement les 3 sites de H (car trois fragments pour H seul) ont été difficiles à placer, l'un se trouve près de E1 et B1, un autre proche de E2 et le dernier après E2 voir image 3.
J'ai vérifié tout semble correspondre (notamment B+H : dans le sens horaire en partant du B à gauche on a le fragment B1 B2 = 3000pb, B1 H1 qui donne 10pb ou - (pas visible), H1 et H2 = 600pb, H2 H3 = 2700 pb et H3 B1 = 5700 pb et H + E : H1 E1 = 10pb pas visible, E1 H2 = 600pb, H2 E2 : 700pb, E2 H3 : 2000pb et H3 H1 = 8700pb).
Qu'en pensez-vous sachant que le fragment d'intérêt (B1 B2) ne présente aucun site de restriction ce qui me paraît un peu bizarre (on ne peut pas vérifier si le fragment a bien été inséré sans digestion d'un site spécifique au fragment considéré).
Merci d'avance.
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