Global Analysis of Protein Activities using proteome chips

[LauretteB]

Bonjour à tous,

Pouvez vous m'aider à comprendre (au moins dans les grandes lignes cette publi ?!) Pièce jointe 239696
Je suis incapable d'en comprendre le but précis. Bien que je connaisse les biopuces.


Merci pour vos explications !

Pièce jointe supprimée.
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[JPL]

Désolé mais l'en-tête de l'article porte comme mention :

This copy is for your personal

Et je passe sur le détail des règles qui y font suite. La diffusion publique de cet article n'est donc pas permise.

[biseibutsu]

Bonjour,

Et oui, les articles de Sciences sont bien protégés... Pour le résumé : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11474067
Cet article à plus de 10 ans (déjà!) et depuis, la situation n'a pas beaucoup évolué...
Plus récent, une revue récente (2012) qui liste les différents types de puces "protéiques". Il y cite également le papier que vous devez analyser (Partie B-1) Protein–protein interaction). L'article est en accès libre, merci PMC! => http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3790149/

Bonne lecture.

Si vous avez des questions sur les puces protéiques, n'hésitez pas (même si je ne suis pas un grand spécialiste)

[LauretteB]

Merci ! Oui j'ai du mal à comprendre le but précis de cette publi . Que font ils exactement ? Je ne comprend pas trop pourquoi le pdf a été supprimé étant donné que l’article est téléchargeable par tous sur google ! il suffit de taper le titre...

[A voir en vidéo sur Futura]

[biseibutsu]

En effet, le PDF est trouvable sur le net, via le site d'une école/université (d'où le .edu). Mais FS est très respectueuse du droit d'auteur, heureusement (contrairement à cette école, apparemment).

Pour en revenir à la publication.
Leur but était de montrer qu'il est possible de créer une puce d'affinité aux protéines. Bref, admettons que tu étudies une protéine, au hasard la calmoduline (c'est dans le papier). Tu déposes donc ta protéine marquée et purifiée sur ta puce, puis tu regardes où elle s'accroche. Chaque point qui s'allume indiquera une interaction direct entre la calmoduline et la protéine fixée. Et vu qu'il y a environ 5800 protéines sur la puce (pour la levure), cela te permet de tester en une seule expérience une (très) grande quantité d'interactions.
Ce papier a pu faire un Science car les autres puces protéomiques n'avait pas ce nombre de protéines testées, ni cette sensibilité en 2001. De plus, cette puce permet d'observer les interactions protéine-protéine, mais également protéine-lipide (pour le transport des lysosomes, par ex), ce qui est complètement nouveau à cette échelle. De fait, a seconde partie du papier se concentre sur ces interactions protéine-lipide.
Attention comme même, ce papier n'est pas parfait, et les auteurs le savent C'est entre autre pour cela qu'ils confirment leur résultat protéine-lipide par une autre technique par exemple.

Car finalement, on retombe toujours dans la grande problématique des puces protéiques (problème que n'a pas les puces ADN) : la fixation de la protéine sur le support d'observation. En effet, il faut bien fixer la protéine par un bout sur le support. Or, ce morceau fixé ne peut alors plus (ou très peu) interagir avec des protéines avec laquelle il aurai interagit normalement. De plus, la fusion de la protéine avec le GST peut également perturber sa structure tri-dimensionnelle. Ca, ce sont pour les inconvénients (de toute puce protéiques).
Son avantage majeur reste qu'il devient possible de tester rapidement et pour peu cher les interactions d'une protéine sur un quasi-protéome, même s'il faut confirmer les résultats après avec une autre technique, cela permet de réduire grandement le temps de recherche (et le nombre d'étudiant faisant du double hybride )

[LauretteB]

Alors là super. C'est incroyable comme tu m'éclaires ! Je fais des nanotechnologies en faite, mais j'suis pas une pro en bio... J'avance dans l'étude et je manquerais pas de revenir vers toi pour des questions peut etre plus précises N'hésite pas en tout cas si t'as des infos complémentaires à me filer.

[biseibutsu]

Pas de soucis pour les questions.
Au niveau des infos complémentaires, il y en a des tonnes, mais ce sont généralement des détails.

Mais si tu dois te lancer dans l'étude de puces protéomiques (ou autre), je te conseille vivement de lire la revue de Zhu et al. de 2012 intitulé "Applications of Functional Protein Microarrays in Basic and Clinical Research" dont j'ai donné le lien précédemment (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3790149/). Il donne un nombre incroyable de pistes, de papiers et de méthodes différentes.

[LauretteB]

Je ne comprend pas l'intêret de cette manip :

"The yeast expression strains contain individual plasmids in which the correct yeast ORFs have been shown to be fused in-frame to GST by DNA sequencing. The proteins were expressed in yeast to help ensure that the proteins were modified and folded properly. Using a 96-well format, 1152 samples were purified at once from yeast extracts using glutathione-agarose beads (10). We included 0.1% Triton in the lysis buffer and washes to ensure that the purified proteins were free of lipids. The quality and quantity of the purified proteins were monitored using immunoblot analysis of 60 random samples (Fig. 1A). Greater than 80% of the strains produced detectable amounts of fusion proteins of the expected molecular weight."

Merci,

LB

[biseibutsu]

C'est la partie où ils produisent leurs protéines pour composer une librairie.
En gros, la séquence d'ADN codant pour la protéine d’intérêt est fusionnée à une séquence "signal" (GST), puis des levures sont transfectées par le plasmide. Donc production de la protéine correctement modifiée et conformée (la protéine d'origine provient de la levure). Ils purifient ensuite la protéine d’intérêt (grâce à la séquence GST). Sur les 1152 protéines différentes produites en même temps par cette méthode, ils en sélectionne aléatoirement 60 pour les tester par WB (afin de vérifier l'expression de la protéine d’intérêt)..

[LauretteB]

Ok, mais le but est bien d'étudier le protéome de la levure ? Donc pourquoi utilise t il des protéines de fusions ? et ils réalisent un clonage mais c'est bien 5800 protéines différentes de la levure qu'on étudie ? sinon pourquoi parle t on de protéome ?

[biseibutsu]

mais le but est bien d'étudier le protéome de la levure ?

Tout à fait

Donc pourquoi utilise t il des protéines de fusions ?

Dans une puce, tu dois savoir où se situe telle ou telle protéine. Ce n'est pas très difficile pour l'ADN (avec la synthèse directement sur la puce, par exemple), mais pour les protéines, c'est plus compliquée. il faut déjà avoir une protéine purifiée, et qui puisse s'accrocher sur le support.

ils réalisent un clonage mais c'est bien 5800 protéines différentes de la levure qu'on étudie

Le clonage est la façon la plus simple pour produire, purifier et accrocher 5800 protéines. Donc le clonage a été réalisé 5800 fois sur 5800 protéines différentes. Puis ils ont réalisé 5800 bouillon de culture pour produire les 5800 protéines, qu'ils ont ensuite purifiées (grâce à l'étape du clonage). Une fois les 5800 protéines purifiées (dans 5800 tubes différents, hein), 5800 dépôts sont réalisés sur un support spécial (lame recouvert de Nickel, si je me souviens bien). Et la puce est ainsi réalisée.

pourquoi parle t on de protéome ?

On a une protéine de fonction inconnu (ou peu connu). On la produit et la purifie grâce à une méthode identique. Puis on dépose ensuite cette protéine sur l'ensemble de la puce (très diluée, la protéine test, hein!). Puis on révèle où s'accroche la protéine testée : on trouve donc tout les partenaires directs de la protéine (et donc potentiellement les différentes voies et/ou métabolisme où la protéine est impliquée).
Donc les auteurs disent qu'ils ont testé l'interaction direct de cette protéine sur tout (en fait 80%) du protéome.

Je ne sais pas si je suis assez clair... N'hésite pas!

Ah, bien sur, tout ces manipulations sur 5800 clones n'est généralement pas réalisé à la main, mais à l'aide de robots. Vive la technologie

[LauretteB]

Concernant les figures, la figure 2A correspond au test de la calmoduine et les PI (ce sont les lipides) et PC (?). De plus la sonde (alpha-GST) nous permet juste d'observé la zone étudier de protéine ?
La figure 2B représente la recherche du motif appartenant à la Calmoduline.
La figure 3 détermine les liaisons forte ou faible des lipides, mais pourquoi fais t on cela ? comment fait on ? les noms comme STTP22 sur le coté corresponde à quoi ?

[LauretteB]

Merci ! heureusement qu'il y a des gens comme toi pour expliquer. Je suis un peu perdu dans tout ces termes biologique ^^

[biseibutsu]

Ok, j'ai pigé le truc

la figure 2A correspond au test de la calmoduine et les PI (ce sont les lipides) et PC (?)

Tout à fait! La PC est la phosphatidylcholine, qui est également un lipide. J'ai eu un peu de mal à le comprendre, au début

De plus la sonde (alpha-GST) nous permet juste d'observé la zone étudier de protéine ?

Pas tout à fait. ils ajoutent en fait une sonde qui détecte tout les fragments GST. Cela leur sert de contrôle, et ainsi de vérifier la présence (ou l'absence) de leur protéine. Cela doit également leur permettre de faire une étude semi quantitative (d'où le strong et weak).

La figure 2B représente la recherche du motif appartenant à la Calmoduline.

Pas tout à fait exact : représente plutôt le motif de liaison (des partenaires identifiés) se liant à la calmoduline

La figure 3 détermine les liaisons forte ou faible des lipides

Avec les protéines, oui

pourquoi fais t on cela ?

Pourquoi pas? Le métabolisme des lipides est (très) compliqué. savoir que telle protéine interagit avec telle lipide peut permettre d'améliorer la compréhension.
Les protéines interagissent avec tout (ADN, ARN, autres protéines, lipides, sucres, vitamine, hormones...). Ils auraient aussi pu choisir un autre comosants. Mais le fait de le réaliser avec des lipides est comme même plus difficile (cela reste de l'huile comme même!).

comment fait on ?

Ils ont utilisés des liposomes (micro-bulle de lipide) créés artificiellement avec le lipide de leur choix. Ils ne précisent pas comment, mais j'imagine que c'est en utilisant des puces micro-fluidiques.

les noms comme STTP22 sur le coté corresponde à quoi ?

Ce sont les noms des protéines. Sur le côté gauche, tu as le nom des protéines interagissant avec les lipides, en haut à gauche, le type de lipide, au milieu la quantification de l'interaction (la séparation fort ou faible vient de se paramètre), à droite la localisation de la protéine dans la membrane cellulaire, si c'est une kinase ou si sa fonctio est inconnu.

[LauretteB]

Et est ce que ils utilisent des techniques généralement utilisé en protéomique, quels sont leur noms ? (pour la création de la puce, pour l'interactions protéines-protéines, et pour l'interaction protéine lipides ?)
car en matière de protéomique, on parle souvent de spectroscopie de masse, électrophorèse, double hybrides, La technique TAP-TAG, ...)

Il existe deux façon de séquencées les protéines : le séquençage réel des acides aminés ou le séquençage d'adn du gène correspondant. Nous somme bien dans le dernier cas ?

[biseibutsu]

Le problème avec la protéomique, ou l'étude du protéome, c'est que techniquement, c'est très difficile à réaliser. Principalement à cause des modifications post-traductionnelles de la protéines, ce qui peut changer sa fonction.
De nombreux laboratoires de recherche (dont celui dont je fais parti) sont très actif sur la protéomique, et tout type de technologie est utilisé, parfois en mixant (mixer l'électrophorèse avec la spectro de masse MS/MS est ce qui donne de meilleur résultat pour le moment).

Donc je reprends : l'étude du protéome, c'est étudier la composition en protéines d'un extrait cellulaire (l'idéal étant d'une cellule unique) avec suffisamment de précision pour différencier les changements post-transcriptionnel des protéines.

Dans ce papier, les auteurs ne se proposent pas d'analyser le protéome de cellules, mais d'analyser les partenaires d'une protéine test (ou autre composé, comme des lipides) en utilisant l'ensemble du protéome comme référence. C'est donc complètement différent du fonctionnement d'une puce à ADN.

Il existe deux façon de séquencées les protéines : le séquençage réel des acides aminés ou le séquençage d'adn du gène correspondant. Nous somme bien dans le dernier cas ?

Oui. ils savent quelle clone correspond à chaque spot, donc quelle était la protéine correspondante, donc la séquence génomique codant pour la protéine. Mais ce n'est pas en soit une façon de séquencer des protéines.
Si tu as une protéine complètement inconnu, et pas son ADN, il faudra séquencer les acides aminés de la protéine un à un (en tout cas, le début de la protéine), avant de pouvoir trouver la séquence ADN.