Salut tout le monde !
je veux faire l'extraction de l'ADN parasitaire,Trichomonas vaginalis à partir de son milieu de culture. j'ai essayer deux kits, celui de Qiagen et de Invitrogen mais la concentration de l'ADN et toujours trés faible à l'ordre de 10ng !!
Est-ce QUE c normal?!
Sinon comment je peut faire un bon prétraitement pour avoir un bon culot?
Aidez moi SVP! Je me bloque!
Je créee une nouvelle discussion pour ce problème. Bon courage
Bonsoir
mais où c'était déplacé SVP?
Ici même !
ok c'est bon
vous arrivez à extraire 10ng d'ADN c'est déjà pas tu faire des prc. mais si tu veux augmenter la concentration il faut centrifuger plusieurs fois afin d'accroître la quantité des cellules et par conséquent la quantité ADN à extraire.
Salut.
Je pense que c'est ton kit et la manière dont tu t'en sert qui te fait perdre de la concentration.
Donc si j'ai compris tu fais une culture overnight de ta bactérie, au nom si romantique, en milieu liquide et le matin tu centrifuge le bordel (full speed 10min) et la dessus tu commence le kit, right ?
Alors si ta un gros culot de bactérie c'est que il y a pas de raison que tu te retrouve pas à 100ng/µl à la fin. Sinon ça peut être que l'origine high-copy de ton plasmid à une mutation fatidique mais normalement pas.
Donc ceci je connais pas ton kit mais par expérience j'ai remarqué que si tu double tout les temps (temps de centri, temps d'incubation) t'améliore le rendement de purif. Moi même je laisse au moins 10 min pour la première incubation ou l'ADN entre en contact avec la résine (si c'est un kit avec des petite colonne que tu utilise). Ensuite au moment ou tu centrifuge pour sécher la résine après les lavage successif à la "washing solution" tu claque au moins une centri de 5 min pour bien sécher le bordel. Ensuite si l'élution de fait avec de l'eau stérile tu peux chauffer l'eau un peu genre 60°C ça améliore la récup d'ADN. Si l'élution c'est une solution du kit la chauffe pas. Normalement ça devrait être bon si tu le fais bien précautionneusement. Sinon faut chercher du côté de ton plasmid si il a pas un souci de réplication.
Sinon tu claque une extraction au chloroforme mais je te conseille pas X)
bonne chance A+
Tu pense que je dois par exemple centrifuger aussi le surnagent après la récupération du culot pour avoir plus d'ADN?
à noter que je fait une centrifugation à 2000g/10min pour débarrasser du milieu puis une double centrifugation pour laver avec le PBS 10%
Cher JakiJake, voilà comment je procède; j'attends le jour de croissance maximale de mon parasite ( Trichomonas vaginalis est un parasite vaginale responsable d'infection vaginale sexuellement transmissible), je fait comme j'ai mentionné au dessus presque 3 centrifugation (2000g/10 min) jusqu’à d'un l'obtention d'un grand culot que je le divise dans 3 tube eppendorf de 1.5 ml puis je commence l'extraction par l'ajout de tampon de lyse et la proteinase K, je vortex puis je les incube pendant 15 min dans le bain mari à 56°C... puis j'ajoute RNase et je centifuge, puis l'éthanol et je vortex et je déplace la solution lysée au colonnes de résines je centrifuge 10.000g/1 min et je jette le tube collecteur. après je fais l'étape de lavage avec deux tampon de lavage 1 et 2 et je centrifuge chaque fois (vitesse maximal/3 min)
Enfin l'élution par centrifugation à vitesse max pendant 1 min et laisse incuber 1 min.
Voilà !
