96-well plates Beer-lambert
Coucou,
Petite question: dans une plaque de 96 puits, le "l" c-à-d la longueur utilisée dans la loi de Beer-lambert ( 1 cm normalement en cuvette normale) correspond à quoi (la lumière passe comment, c'est la hauteur du puits ou le diamètre?)
nb: si vous avez une idée de valeur je suis prenante car j'ai oublié de la mesuré... (96 puits fond plat)
Merci!
La mesure s'effectue en transmission. Le faisceau arrive par le dessus du puits et est mesuré en dessous (ou l'inverse).
Le L correspond au trajet optique, c'est a dire la hauteur de solution traversée. Tu pourrais la calculer en connaissant le volume de solution ajouté dans le puit et le diamètre du puits (environ 6.4mm pour une plaque 96 puits habituellement). Il faut bien évidemment soustraire la valeur du blanc.
...Maintenant, la valeur ainsi trouvée sera fausse, car ce n'est pas fait pour !
La seule façon d'avoir une mesure correcte est de comparer l'absorbance mesurée dans ton puits avec celle donnée par une gamme étalon.
Merci!!! c'est une belle réponse j'ai compris!!
Cependant, on est toujours obligé de faire un étalon ou on peut considérer que l'erreur est faible?
Dans mon cas, je ne vois pas comment faire une gamme étalon car la couleur de mon substrat est non visible au départ et il devient jaune juste quand on ajoute de la trypsine (mesure la décomposition à 410 nm au cours du temps). Je dois faire la gamme étalon en ajoutant la trypsine dès le départ? mais à ce moment là l'absorbance ne sera pas stable et va varier au cours du temps... J'ai peut-être zappé quelque chose avec la gamme étalon, pour moi c'est faire différentes concentrations en composé qu'on veut mesurer (donc connues) et déterminer la concentrationde ce composé dans la solution inconnue.
Ou alors il faudrait laisser exactement le même temps d'hydrolyse et prévoir des concentration en substrats différents mais ca m'a l'air compliqué (si on arrive dans les conditions limites du substrat pour l'enzyme il va avoir une erreur, non?)
La prochaine fois je prend des cuvettes où l=1^^
Merci!
Dernière modification par mailaure ; 28/07/2014 à 18h28.
Quel est le but de l'expérience ? As tu réellement besoin de connaitre la concentration de ton espèce en solution ?
Re : 96-well plates Beer-lambert
le but de l'expérience c'est de mesurer l'activité spécifique de ma trypsine (subtrat Bapna) en présence des différentes fractions de cultures bactériennes (car je produit un inhibiteur et j'aimerai voir si il y inhibition).
Seulement une fois que j'ai mesuré la pente de ma droite (mA/min j'ai fait une mesure toutes les 10 sec pendant 10 min), j'aimerais mettre ça en activité spécifique et pour ca il me faut le "l" de la loi de beer-lambert... comme j'ai fait ca dans des plaques de 96 puits car j'avais bcp d'échantillons, je savais pas si le "l" je pouvais prendre la hauteur du liquide?
La concentration de Bapna finale m est égale (je me suis mis au dessus du Km pour être sur qu'il n'est pas la limitation, il est en excès), je veux juste savoir l'activité spécifique de mon enzyme.
Voilà, Merci!
Dernière modification par mailaure ; 29/07/2014 à 08h10.
La mesure en plaque 96 puits ne sera pas précise.
Peut-être n'es tu pas obligée de faire la mesure de l'activité spécifique, en cuvette, pour toutes les conditions ? Tu peux faire une mesure de l'activité spécifique de ton enzyme sans inhibiteur, en cuvette (=ton contrôle positif). Les mesures en présence d'inhibiteurs, faites en plaques 96 puits, peuvent être exprimées en pourcentage d'inhibition.
Dernière modification par vpharmaco ; 29/07/2014 à 17h09.
Re : 96-well plates Beer-lambert
Ok merci beaucoup
