Hello
J'ai depuis longtemps un problème récurrent et personne de mon entourage n'a d'explication vérifiable ni de solution définitive. Mes westerns ont des marbrures plus claires (voire blanche) comme si ça n'avait pas bien marqué à ces endroits là. Voir image (si ça marche) :
Tache blanche au milieu vers le bas.
-Le transfert sur membrane de nitrocellulose s'est bien passé et le ladder est complètement visible contrairement à ce que l'on voit sur celui du milieu après marquage.
-Le blocage se fait dans des petits bacs à plat (lait écrémé ou BSA selon anticorps). Le volume semble suffisant et j'ai essayé avec plus sans faire mieux.
-Les incub d'anticorps se font dans des gros tubes (type Falcon 50 ml) sur un "rouleur" avec 5 ml d'anticorps. Le volume semble suffisant ; j'ai toutefois déjà testé 10 ml mais ce n'était pas mieux.
-La révélation des anticorps secondaires HRP se fait à l'ECL (1ml), à plat. Je surveille bien sa répartition pendant les 2 min d'incub. Je ne pense pas non plus que ça vienne d'une mauvaise répartition ici car si je remet de l'ECL plus tard les taches claires sont exactement aux mêmes endroits.
Le problème est surtout visible avec des blocages BSA et incub d'anticorps contre des prots phosphorylées, qui donnent des westerns avec plus de bruits de fond, d'où taches visibles...
Je suis régulièrement obligé de déshybrider la membrane et refaire blocage/incub etc pour avoir les taches en dehors de mes bandes -pas au même endroit sur la même membrane- (ou pas du tout parfois). Donc le pb est pendant blocage/incub. Mais je ne trouve pas quoi malgré mes différents essais.
Heeeelp ! Ca me saoule de perdre du temps à ça.
Merci d'avance pour toute suggestion/solution.
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K.
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