Bonjour, je me vous sollicite car j'ai une petite question. Je souhaite produire et purifier une protéine à partir d'un ADNc codant pour cette protéine.
je pensais à transfecter une cellule CHO avec un plasmide contenant l'ADNc. La machinerie cellulaire va synthétiser la protéine mais ensuite comment isoler et purifier la protéine ?
je pensais à faire une lyse cellulaire et une centrifugation mais ensuite ? la protéine est une protéine membranaire ?
D'avance merci pour votre aide
Salut
Classiquement on "tag" la protéine et on la purifie grace à ce tag par affinité (genre GST).
Le problème est que les protéines membranaires sont généralement très hydrophobes et n'aiment pas du tout être extraites des membranes! ca risque d'être pas mal galère pour trouver les bonnes conditions de purification.
YOyo
Probablement plusieurs centrifugations avec resuspension des culots successifs dans des solvants de moins en moins polaires ?
"Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche
je dirais que cela dépend de l'utilisation que vous voulez en faire. Est ce que la protéine doit rester native ? est-ce qu'il faut la dénaturer ? quelle est la pureté requise ?
Bonsoir,
Il faut faire attention lors de la synthèse, choisissez bien votre promoteur, cherchez dans la littérature il doit exister des constructions particulières pour les protéines membranaires. Faites également très attention au détergent que vous utiliserez lors de l'extraction pour essayer de la garder votre protéine la plus soluble possible. Pour après, une solution c'est la reconstitution en liposome ce qui vous serait peut-être très utile pour une étude fonctionnelle. C'est ce que vous voulez en faire qui dictera le protocole à utiliser: grande quantité ? pureté ? etc.
Bon courage
Camu
