Problème de biologie moléculaire

[I0S_6]

Bonjour à tous !

Me voilà face à un exercice problématique ... J'ai sans doute oublié pas mal de ma théorie, mais je pense avoir déjà une bonne partie.

Je fais face à une question qui est la suivante:

Imaginons que j'ai isolé un mutant grâce à des ARN interférents afin d'en avoir un avec une membrane plasmique d'intégrité réduite. Maintenant, j'ai taggé le gène en question avec de la GFP et je remarque que le produit de ce dernier est entièrement localisé dans le noyau de la cellule.
Maintenant je dois montrer (à l'aide d'expériences) la base derrière cette localisation et si cette localisation contribue au phénotype observé (intégrité de la membrane réduite).

Donc, mon idée c'est que l'on parle là de facteurs de transcription, d'où leur localisation. On peut ensuite imaginer que si c'est un repressor on aura moins d'une proteine trans-membranaire X de transport et donc désquilibre osmotique. Idem avec le fait si c'est un activateur et qu'on a trop de protéines de transports, équilibre aussi perturbé (prenons le worst case scenario).
Donc pour tester le fait que c'est un facteur de transcription, j'utiliserai un "electrophoretic mobility shift assay" (EMSA). Vu que je connais mon gène, je le réplique en masse et le met en contact avec un extrait nucléaire. Des protéines vont s'y lier et ralentir la migration, confirmant mon hypothèse du facteur de transcription.
Ensuite, pour prouver que la localisation contribue au phénotype... Je ferai une modif' rapide au gène, j'y ajouterai un TAG de signal d'exportation nucléaire, ensuite je pourrai vérifier à l'aide de a GFP que la protéine ne se trouve plus dans le noyau et grâce à un test d'intégrité de la membrane au Calcium (classique), je pourrai vite voir s'il y a une différence entre la cellule avec le facteur exporté et non exporté du noyau.

VOILA !

Qu'en pensez-vous ? J'ai oublié un truc, ça semble plausible ?
Ma biologie moléculaire est un peu rouillée.. !

Merci d'avance à toutes et à tous pour votre aide précieuse
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[Flyingbike]

bonjour

Imaginons que j'ai isolé un mutant grâce à des ARN interférents afin d'en avoir un avec une membrane plasmique d'intégrité réduite. Maintenant, j'ai taggé le gène en question avec de la GFP et je remarque que le produit de ce dernier est entièrement localisé dans le noyau de la cellule.

vous avez ciblé quoi ? dans quel type d'organisme êtes vous ? le gène est connu (séquence, etc..) ?

Donc, mon idée c'est que l'on parle là de facteurs de transcription, d'où leur localisation. On peut ensuite imaginer que si c'est un repressor on aura moins d'une proteine trans-membranaire X de transport et donc désquilibre osmotique. Idem avec le fait si c'est un activateur et qu'on a trop de protéines de transports, équilibre aussi perturbé (prenons le worst case scenario).

Admettons, mais il n'y a pas que des FT dans le noyau...

Donc pour tester le fait que c'est un facteur de transcription, j'utiliserai un "electrophoretic mobility shift assay" (EMSA). Vu que je connais mon gène, je le réplique en masse et le met en contact avec un extrait nucléaire. Des protéines vont s'y lier et ralentir la migration, confirmant mon hypothèse du facteur de transcription.

pour un EMSA, il faut une sonde ADN, donc savoir un minimum sur quoi peut s'accrocher votre protéine. Il faut mieux définir votre expérience. Protéine produite + ADN +/- extraits protéiques ? Vous avez un anticorps contre votre protéine pour faire un super shift ? et si l'interaction n'est pas directe ? Dans ce type d'expé, une interaction ne suffit pas pour dire que c'est un FT, de la même façon que l'absence d'interaction ne suffit pas pour dire que ce n'en est pas un...

Ensuite, pour prouver que la localisation contribue au phénotype... Je ferai une modif' rapide au gène, j'y ajouterai un TAG de signal d'exportation nucléaire, ensuite je pourrai vérifier à l'aide de a GFP que la protéine ne se trouve plus dans le noyau et grâce à un test d'intégrité de la membrane au Calcium (classique), je pourrai vite voir s'il y a une différence entre la cellule avec le facteur exporté et non exporté du noyau.

attention avec la GFP... C'est un gros tag qui peut a lui seul modifier la localisation de la protéine (et sa fonction)

Si vous connaissez le gène, il doit y avoir un NLS, c'est peut être plus simple de partir par la...


J'attends vos retours pour compléter si vous voulez.

[I0S_6]

Bonjour Flyingbike, merci pour ta réponse

vous avez ciblé quoi ? dans quel type d'organisme êtes vous ? le gène est connu (séquence, etc..) ?

C'est une question théorique sur laquelle je suis tombé pour un exercice. L'énoncé ne précise pas l'organisme, toutefois il précise la présence d'un noyau. L'énoncé ne dit rien non plus à propos du gène. Il est dit qu'après avoir fait un screen aux RNAi pour des mutants dont l'intégrité de la membrane est réduite, un mutant est sélectionné et le produit du gène touché par le RNAi est taggé à la GFP. Je suppose que l'on connait donc son emplacement et sa séquence, si on connaît le RNAi utilisé dans ce cas, ce qui a du sens, autrement le screening perds beaucoup en pertinence. De plus, l'énoncé dit que le gène a été tag à la GFP, je suppose que la séquence/emplacement sont connus.

Admettons, mais il n'y a pas que des FT dans le noyau...

Tout à fait d'accord avec toi !
Toutefois, l'énoncé précise encore que la luminescence est observée dans le noyau et que cela a un impact sur l'intégrité de la membrane. Je n'ai pas eu d'autre idée que des FT... Si tu en as, je me réjouirai d'en connaître la nature et d'apprendre !

pour un EMSA, il faut une sonde ADN, donc savoir un minimum sur quoi peut s'accrocher votre protéine. Il faut mieux définir votre expérience. Protéine produite + ADN +/- extraits protéiques ? Vous avez un anticorps contre votre protéine pour faire un super shift ? et si l'interaction n'est pas directe ? Dans ce type d'expé, une interaction ne suffit pas pour dire que c'est un FT, de la même façon que l'absence d'interaction ne suffit pas pour dire que ce n'en est pas un...

Encore une fois, oui tout à fait. Je me suis rendu compte après avoir posté que EMSA ne jouerait pas. En effet, on ne peut pas avoir de sonde ADN vu que l'on ne sait pas où s'attache notre prétendu TF. Du coup, j'ai pensé à l'expérience "parallèle", celle du footprint, avec la digestion à la DNase I. On aura un ladder pour l'ADN non mélangé à l'extrait nucléaire et un ladder avec une absence "d'échelons" au niveau de l'interaction protéine/ADN. L'énoncé ne précise pas l'utilisation d'anticorps pour provoquer ce super-shift. Mais c'est envisageable, la question est ouverte ! Merci pour ces quelques détails, je ne suis de loin pas au courant de tout à ce niveau là. Est-ce qu'une expérience footprint résolverait quelque soucis ? Je pourrai travailler avec une plus grande quantité d'ADN, ne sachant pas où se lie mon prétendu TF, cela semble plus pratique... ?

attention avec la GFP... C'est un gros tag qui peut a lui seul modifier la localisation de la protéine (et sa fonction)
Si vous connaissez le gène, il doit y avoir un NLS, c'est peut être plus simple de partir par la...

Hm... Pensez-vous que la protéine se situe dans le noyau car elle n'arrive plus à sortir à cause de la GFP ? Et que l'impact sur l'intégrité de la membrane est dû au fait que cette protéine n'est justement pas exprimée ? Je pose la question, même si je pense que cela n'est pas le cas... La traduction s'effectue dans le cytoplasme de la cellule. Si la GFP donne un signal à l'intérieur du noyau, cela veut dire que la protéine a été importée, sinon elle serait bloquée dans le cytoplasme. De ce fait, cela me porte à croire qu'il s'agît bien d'un TF ou quelque chose d'autre qui influe sur une protéine liée à l'intégrité membranaire.

Merci d'avance pour la lecture et les réponses riches en savoir pour moi, qui apprends !

[Tibosax]

Personnellement je partirais sur un ChiP, séquencerais une dizaine de produits, synthétiserais les-dits produits, et effectuerais un gel-shift avec quelques un. Avec un peu de chance ça peut être suffisant si c'est bien un facteur de transcription. Et si tu vas jusqu'au ChiP-seq, tu peux même trouver la séquence du motif reconnu par le TF.

C'est quand même assez étrange de donner ce genre d'exercice en 2016. Désormais quand on connait le gène en question, on commence par une analyse bioinfo pour déterminer la famille de protéines à laquelle elle appartient, si il y a des motifs d'interaction à l'ADN, ou à l'ARN.

Ça pourrait aussi être un facteur de splicing. Certains facteurs ne sont nécessaires à l'épissage qu'à un faible nombre de transcrits, et avec un KD, on peut très bien obtenir un phénotype de ce genre.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

A la lumière de vos précisions, effectivement l'EMSA est peut etre un peu galère (le footprint aussi d'ailleurs) et pour rejoindre Tibosax, avec les techniques, bases de données actuelles, et avec le tarif des analyses a grande échelle, j'aurai fait pareil : déjà voir si la séquence ressemble a quelque chose de connu (il n'y a pas 1000 façons pour une protéine de se lier à l'ADN, et ça on peut le reconnaitre), si elle a des domaines d'interaction avec des protéines connues, et pour compléter, IP, dépôt des protéines sur gel et analyse spectro de masse (en qq jours vous pouvez connaitre toutes les protéines qui interagissent avec votre cible) et/ou Chip-seq (ça reste un peu délicat et cher mais ça ratisse large et c'est très informatif). Mais il y a de multiples façon de procéder et d'envisager les expériences.