Améliorer la quantité, qualité et pureté d'une extraction d'ARN

[cayan10]

Bonjour tout le monde,

J'ai effectué une extraction d'ARN à partir des cellules THP-1 humaines par deux techniques différentes. la technique d'extraction par précipitation en utilisant le trizol et la technique par extraction par colonne utilisant le kit direct-zol ARN miniprep et des colonnes appel zymo-Spin IIC

J'ai obtenue une concentration pour la méthode de précipitation de 1240 ng/µL avec les ratios de 260/280 est de 1,66 et 260/230 la valeur est de 1,59 permettant de dire qu’il y a une très grande contamination en matière organique. Pour l’échantillon de colonne est de 440 ng/µL Pour l’échantillon de colonne, la valeur du ratio 260/280 est de 2,08 permettant de conclure qu’il n’y a pas de contamination protéique. Pour le ration 260/230 est de 2,21 se trouvant dans les valeurs recherchées et permettant de dire qu’il n’y a pas de contamination organique.


De quelle façon, peut-on améliorer la pureté de l'extraction d'ARN


D'autre part, j'ai mesuré la qualité de l'extraction en mesurant le ration 28S/18S pour chaque méthode utilisé. Pour l’échantillon de précipitation le ratio est 1,39. Pour l’échantillon colonne le ratio est de 1,28 . Je remarque qu'il y aune plus grande dégradation dans les échantillons où la méthode par colonne a été fait contrairement aux échantillons fait par la méthode par précipitation. Je voudrai savoir ce qui explique la dégradation de l'ARN ou bien l'origine de la coupure de l'AARN visible.

ici de quelle façon on peut améliorer la qualité de l'extraction ?

Si vous avez de référence ça serait très utile

Merci et bonne journée
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[Flyingbike]

C'est très complexe.

De façon générale, le matériel en colonne est plus propre notamment parce qu'on évite plus facilement les contaminations par "carry over", par contre je suis étonné que vos ratios 18/28S ne soient pas meilleurs...

Le début de l'extraction est très important : conditions d'homogénéisation (mécanique, chimique), il faut se mettre à froid, ainsi que la quantité de matériel (trop est pire que pas assez !). Comment avez vous procédé ?

Pour l'extraction au trizol il vaut mieux rester à froid.


Comment avez vous mesuré vos ratios ? sur gel, bioanalyser ?

Je ne comprends pas trop ce qu'on doit voir sur votre gel

[cayan10]

Bonjour,

Je me suis trompé d'image. Voici l'image de la migration des échantillons pour les 2 méthodes Mon coéquipier et moi avons fait les mêmes méthodes donc on a 2 échantillons de chaque méthode. Toutefois, dans les échantillons extrait par colonne sont plus dégradés ce que j'arrive pas à comprendre

Pour la méthode de précipitation on a centrifugé les cellules pour avoir un culot des cellules. Ce culot a été disperser au maximum à l'aide d'un vortex. Le trizol a été ajouté sous une haute chimique à température pièce, on a vortexé pour homogénéiser , les étapes subséquentes ont été effectuées à température pièce jusqu'à l'ajout d'isopropanol où une incubation dans la glace de 10 minutes a été effectuée

Pour la méthode par colonne, on ajouté du trizol et on a homogénéisé à l'aide du vortex. On a ajouté de l'éthanol, mais toutes les étapes ont été effectuées à température pièce

Pour les deuxméthodes ont a utilisé des centrifugations à 13 000 rpm , surtout dans la méthode par colonne.Donc, est-ce que le nombre de centrifugations aurait un impact dans la dégradation de l'ARN puisque c'est dans la méthode par colonne où c'est plus visible et c'est dans ce méthode qu'on trouve le plus de dégradation

Pour le chargement sur le gel d'agarose 1%. on a fait des échantillons de 0,2µg/µL . donc lors du chargement on a fait migrer 10µL du ARN à 0,2µg/µL

Les ratios 260/280 et 260/230 ont été mésurés par spectrophotomètre. Les ratios 28S/18S ont été mesurés à partir du gel d'agarose à l'aide du logiciel Image J

Quand vous dites qu'il est important d'homogénéiser les échantillons , c'est pour avoir les plus d'ARN possible?

Pour travailler au froid, c'est bien pour conserver le plus long temps possible l'ARN dû à sa fragilité ?

Merci