Expression d'un transgène

[Meiosis]

Bonjour,

J'ai un petit doute.
Si on veut exprimer un transgène uniquement dans un type cellulaire d'un organisme il faut le mettre sous le contrôle du promoteur d'un gène exprimé uniquement dans ce type cellulaire.
Mais admettons que ce gène ne soit pas assez exprimé de base dans le type cellulaire, je vais mettre un promoteur fort en amont du promoteur spécifique, pour augmenter la transcription du transgène.

Mais est-ce que le fait de mettre ce promoteur fort ne va pas déclencher l'expression du transgène dans d'autres tissus, c'est-à-dire là où je ne veux pas qu'il soit exprimé ?

Merci.
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[Flyingbike]

rien ne pourra te confirmer à part l'expérience. La fuite de promoteur est assez classique, surtout avec un transfère ou on peut "oublier" des répresseurs, par exemple.


Il doit exister des systèmes où tu exprimes un facteur de transcription sous contrôle de ton promoteur tissu spécifique, et ensuite ce facteur de transcription avec son propre promoteur s'occupe de ta protéine

[Meiosis]

Merci pour ta réponse.

Mais ça revient au même non ? Puisque ce facteur de transcription sera peu exprimé car l'activité du promoteur spécifique est faible justement.
Ou alors je n'ai pas compris ta réponse, en fait le contexte est le suivant.

Supposons la construction génétique suivante : [promoteur d'adiponectine]-[transgène]
Je veux faire exprimer ce transgène uniquement dans le tissu adipeux, d'où le choix de l'adiponectine. Cependant l'adiponectine est faiblement exprimée de base dans le tissu adipeux donc mon transgène ne sera pas beaucoup exprimé.
Donc je rajoute le promoteur fort pour avoir [promoteur fort]-[promoteur d'adiponectine]-[transgène]

Avec un adénovirus ce dernier ne va pas infecter que le tissu adipeux mais plein d'autres tissus.
Je veux donc éviter l'expression du transgène dans ces autres tissus.
Le promoteur fort va poser problème car le transgène sera beaucoup exprimé dans le tissu adipeux mais aussi dans les autres tissus.

[Flyingbike]

non ça ne revient pas au même, parce qu'enchainer des promoteurs est probablement plus casse gueule que faire un système avec un intermédiaire qui permettrait d'"amplifier le signal"

Donc je rajoute le promoteur fort pour avoir [promoteur fort]-[promoteur d'adiponectine]-[transgène]

Rien ne dit que le promoteur fort ne fera pas de fuite indépendamment du promoteur tissu spécifique, ni qu'il aura un effet positif sur le promoteur tissus spécifique...

Avec un adénovirus ce dernier ne va pas infecter que le tissu adipeux mais plein d'autres tissus.

Je ne sais pas s'il y a des isotypes meilleurs pour le TA, mais par expérience un adéno pour des adipocytes c'est quand même pas fantastique....


Le plus simple est de trouver un promoteur spécifique plus fort, mais d'ailleurs pourquoi celui de l'adiponectine ne le serait forcément pas assez ?

Je veux donc éviter l'expression du transgène dans ces autres tissus.
Le promoteur fort va poser problème car le transgène sera beaucoup exprimé dans le tissu adipeux mais aussi dans les autres tissus.

C'est vrai. Mais ça peut aussi ne pas poser trop de problèmes....



Ce genre de réflexion est interessante, mais malheureusement en transgénèse et promotorologie il y a quand même une grosse part de non prévisible....

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

Je pense à autre chose, qui est classiquement utilisé :

un promoteur fort avec un lox:stop:lox dans la région codante en aval
et une Cre sous contrôle d'un promoteur tissu spécifique

Pas d'expression hors target !

[Meiosis]

non ça ne revient pas au même, parce qu'enchainer des promoteurs est probablement plus casse gueule que faire un système avec un intermédiaire qui permettrait d'"amplifier le signal"

Ok donc c'est mieux de faire comme tu dis. Je pensais que cela revenait au même mais c'est vrai que c'est plus propre comme ça.

Rien ne dit que le promoteur fort ne fera pas de fuite indépendamment du promoteur tissu spécifique, ni qu'il aura un effet positif sur le promoteur tissus spécifique...

Ok je ne savais pas.

Je ne sais pas s'il y a des isotypes meilleurs pour le TA, mais par expérience un adéno pour des adipocytes c'est quand même pas fantastique....

En fait c'est moi qui me suis mal exprimé sur ce fil, ils utilisent plutôt un virus adéno-associé. J'avais vu ça sur cet article et apparemment ils ont confirmé l'efficacité pour les 2 types de tissu adipeux : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3837045/

Le plus simple est de trouver un promoteur spécifique plus fort, mais d'ailleurs pourquoi celui de l'adiponectine ne le serait forcément pas assez ?

J'ai pas de confirmation réelle mais apparemment l'adiponectine n'est pas tout le temps exprimé mais plutôt en réponse à certains facteurs (selon la page wiki que j'ai lue assez rapidement).
Mais cela ne veut pas dire que l'expression basale est faible.

De toute façon j'ai aussi une autre protéine : l'adipocyte protéine 2 qui apparemment est exprimée de manière plus importante que l'adiponectine.

C'est vrai. Mais ça peut aussi ne pas poser trop de problèmes....



Ce genre de réflexion est interessante, mais malheureusement en transgénèse et promotorologie il y a quand même une grosse part de non prévisible....

Je vois, ça dépend vraiment en fait.
Mais il est bien d'éviter tout problème à l'avance, dans la mesure du possible. Parce qu'en plus pour savoir si l'expression est confinée au seul tissu d'intérêt, in vivo, ça peut être difficile parfois.

Je pense à autre chose, qui est classiquement utilisé :

un promoteur fort avec un lox:stop:lox dans la région codante en aval
et une Cre sous contrôle d'un promoteur tissu spécifique

Pas d'expression hors target !

Mais oui... En plus j'y avais pensé l'autre jour !
Merci.

Par contre parfois les séquences loxP, si elles sont au début du transgène, peuvent gêner l'adressage de la protéine résultante.
Mais si je fais quelque chose du genre :

[promoteur fort]-[loxP]-site +1 de transcription-peptide inutile-terminateur de transcription[loxP]-site +1 de transcription-transgène-terminateur

A priori le loxP n'est pas dans la séquence codante donc ne sera pas retrouvé en N-ter de la protéine, ça passerait ?

Merci.

[Flyingbike]

De toute façon j'ai aussi une autre protéine : l'adipocyte protéine 2 qui apparemment est exprimée de manière plus importante que l'adiponectine.

oui j'avais lu ça également

En fait c'est moi qui me suis mal exprimé sur ce fil, ils utilisent plutôt un virus adéno-associé. J'avais vu ça sur cet article et apparemment ils ont confirmé l'efficacité pour les 2 types de tissu adipeux

oui c'est mieux. de toute façon c'est devenu difficile de publier avec un modèle adénoviral....

Je vois, ça dépend vraiment en fait.
Mais il est bien d'éviter tout problème à l'avance, dans la mesure du possible. Parce qu'en plus pour savoir si l'expression est confinée au seul tissu d'intérêt, in vivo, ça peut être difficile parfois.

Effectivement, il vaut mieux bien y penser comme tu le fais !

[promoteur fort]-[loxP]-site +1 de transcription-peptide inutile-terminateur de transcription[loxP]-site +1 de transcription-transgène-terminateur

A priori le loxP n'est pas dans la séquence codante donc ne sera pas retrouvé en N-ter de la protéine, ça passerait ?

Oui ça devrait passer ! mais de toute façon tout ça se vérifie facilement in vitro avant, pour vérifier les constructions.
Autre avantage : tu peux avoir un contrôle temporel avec ce système

[Meiosis]

Merci pour ces renseignements !