Bonjour,
pensez vous que une extraction d'ADN sur des bactéries E.coli et entérocoques contenus dans une eau de la Seine est possible ? Puis la mise en place de la méthode PCR sur celles-ci pour démontrer leur présence ?
Cela peut-il être trop compliqué avec un équipement de prépa ?
Merci beaucoup
J'ai vu que l'extraction d'ADN (plasmidique du coup) est achetable sur le commerce. Peut-il être fait nous même ?
la PCR sur coli peut se faire directement sur les bactéries (sans extraction d'ADN)
Par contre, comme dans votre question précédente, le problème est la quantité de matériel de départ !
nonPeut-il être fait nous même ?
La vie trouve toujours un chemin
Bonjour,
Il existe sur le marché des solutions pour analyser la présence de bactéries dans un milieu donné. Je pense notamment à des dyes fluorescents. Ce sont des petites molécules qui émettent une lumière de fluorescente lorsque tu les existe à une longueur d'onde précise et ... chapeau elles peuvent être spécifiques de certaines bactéries !
Soit tu veux révéler la présence de la bactérie : tu effectue un prélèvement, tu innocule des boites de pétrie avec des milieux optimisés pour la croissance de coli (LB) et de d'autres entérocoques, tu lyse les cellules et fait une PCR dessus. Là aussi les milieux sont trouvable sur des sites tels que Sigma-Aldrich, Invitrogen etc, et les amorces de PCR aussi !
Soit tu veux quantifier la présence des bactéries : là il faut se tourner vers la qPCR mais cela ne se fait pas avec le même appareillage et c'est légèrement plus compliqué.
En espérant avoir répondu à ta question,
Cordialement
"ici se trouve le chemin, c’est ici que commence notre Grand Voyage."
on peut très bien quantifier des bactéries par dénombrement. C'est d'ailleurs comme ça qu'on pratique en général
La vie trouve toujours un chemin
C'est malheureusement pas une méthode qualitative Flyingbike; tu comptera des bactéries (mortes et vivantes) mais tu ne pourra pas affirmer qu'il s'agisse de coli ou d'une autre totalement inoffensive pour nous ...
"ici se trouve le chemin, c’est ici que commence notre Grand Voyage."
c'est pas tout à fait vrai
Déjà on ne compte que les vivantes (celles qui poussent)
et ca peut être au moins en partie qualitatif : milieux sélectifs, antibiotiques, morphologie, température de croissance, conditions d'a(na)aérobiose, etc.
On peut par exemple dénombrer les entérocoques dans un échantillon avec un milieu adapté
Dernière modification par Flyingbike ; 13/12/2017 à 18h44.
La vie trouve toujours un chemin
Tu les fait pousser sur ton milieu sélectif. Bien. Sauf qu'à tout moment, 100% de ta population n'est pas vivante en train de se répliquer, tu a toujours des cellules en voie de mort cellulaire, voir même des cellules résistantes, ou encore des VBNC (Viable but not culturable), c'est à dire des bactéries qui "décident" de ne pas faire comme les autres. Ceci peut être dû à une hétérogénéité du milieu (plus de nutriment où elles se trouvent) ou encore à la complexité génique.
Toujours est-il que quand tu fais pousser des bactéries pour du dénombrement, tu n'observe jamais que les vivantes.
Pour plus d'info, je me permet de vous suggérer d'étudier l'hétérogénéité métabolique chez les bactéries, c'est un sujet très pationnant !
Ensuite, tout dépend du matos que tu as : une PCR ou qPCR reviens très peu onéreux à faire si tu possède les machines nécessaires.
Faire pousser des boites, il te faut les boites de pétri, un incubateur, du milieu nutritif, des antibiotiques (cher) etc ...
Après, il faut savoir que comme l'à suggéré Flyingbike, des industriels mettent en place des milieux tout prêts, qui "ne laissent pousser que les bactéries que tu désires", à moindre coût ... Je reste septique avec ceci. Beaucoup d'entreprises identifient les bactéries avec ce système, il est fiable et à fait ses preuves.
Les deux fonctionnent et je suis à peut près sûr qu'ils peuvent avoir la même efficacité, ou du moins un efficacité comparable, si tu t'en sert correctement.
Personnellement je serait parti avec une PCR si les conditions s'y prêtaient.
"ici se trouve le chemin, c’est ici que commence notre Grand Voyage."
ça tombe bien c'est le but de la manoeuvreToujours est-il que quand tu fais pousser des bactéries pour du dénombrement, tu n'observe jamais que les vivantes.
c'est un peu fouillis tout ça. ce qui est intéressant dans la qualité bactériologique d'une eau (et c'est le sujet initial, il me semble), c'est le dénombrement de bactéries vivantes, et c'est sur ce critère qu'on les détecte (les fameuses UFC, unité formant colonie). Voir la norme NF EN ISO 7899-2Sauf qu'à tout moment, 100% de ta population n'est pas vivante en train de se répliquer, tu a toujours des cellules en voie de mort cellulaire, voir même des cellules résistantes, ou encore des VBNC (Viable but not culturable), c'est à dire des bactéries qui "décident" de ne pas faire comme les autres. Ceci peut être dû à une hétérogénéité du milieu (plus de nutriment où elles se trouvent) ou encore à la complexité génique.
Je le vois tout à fait dans l'autre sens, personnellement.... Et la PCR (surtout q) peut être bien plus compliquée à mettre en oeuvre (surtout si on veut remonter a un nombre de bactéries)Ensuite, tout dépend du matos que tu as : une PCR ou qPCR reviens très peu onéreux à faire si tu possède les machines nécessaires.
Faire pousser des boites, il te faut les boites de pétri, un incubateur, du milieu nutritif, des antibiotiques (cher) etc ...
je pratique les deux tous les jours, je connais les contraintes et les avantages de chaque, ainsi que le prix des réactifs et des équipements.
Si on veut détecter une bactérie, une espèce, une sous espèce de façons spécifique oui on peut faire de la PCR, mais entre l'extraction, la PCR et son interprétation, c'est plus complexe
Il faut que Changyonlefdp nous en dise plus sur le but exact de son projet
Dernière modification par Flyingbike ; 13/12/2017 à 19h32.
La vie trouve toujours un chemin
Loin de mettre à dos un confrère microbiologiste.
Déjà, je ne connais absolument pas les prix des différentes techniques, c'est pour cela que je les ai évoquées. Je prends tes dires pour vrai, d'autant plus que le dénombrement est une technique répandue dans le diagnostic microbiologique.
J'ai toutefois quelques questions :
- déjà, tu te contredis non ?puisDéjà on ne compte que les vivantes (celles qui poussent)=>tu n'observe jamais que les vivantesEnsuite, pour répondre à la question de départ, il est possible de faire une PCR sur coli ou les entérocoques, sans besoin de lyser les bactéries même si mes souvenirs sont bons. Le problème de la PCR, c'est qu'elle n'est pas exhaustive, et tu pourra détecter, s'il y a suffisamment de matière, qu'un gène ciblé (fonction de tes primers utilisés) ... Sûr, c'est plus compliqué à mettre en place, mais les industriels font de plus en plus de produits permettant de cibler des espèces spécifiques, et le tout sans trop te creuser la tête (à pas dire à un scientifique hein ^^)ça tombe bien c'est le but de la manœuvre
Y'a deux mois, j'ai procédé à une quantification d'ARNm d'une population de E. coli. Je suis pas une pointure dans le domaine mais l'opération est assez simple.
Je suis entièrement d'accord avec toi sur la suite.
"ici se trouve le chemin, c’est ici que commence notre Grand Voyage."
non, j'avais compris "jamais que les vivantes" dans le sens "on ne peut jamais observer autre chose que les vivantes"J'ai toutefois quelques questions :
- déjà, tu te contredis non ?
si c'est "on n'observe pas que les vivantes", c'est faux, puisqu'on dénombre des colonies et donc des bactéries qui ont proliféré jusqu'a devenir visibles. Donc belles et bien vivantes !
coli oui on peut faire une PCR en mettant directement quelques bactéries dans le tube (c'est bien pratique)Ensuite, pour répondre à la question de départ, il est possible de faire une PCR sur coli ou les entérocoques, sans besoin de lyser les bactéries même si mes souvenirs sont bons. Le problème de la PCR, c'est qu'elle n'est pas exhaustive, et tu pourra détecter, s'il y a suffisamment de matière, qu'un gène ciblé (fonction de tes primers utilisés) ... Sûr, c'est plus compliqué à mettre en place, mais les industriels font de plus en plus de produits permettant de cibler des espèces spécifiques, et le tout sans trop te creuser la tête (à pas dire à un scientifique hein ^^)
pour les entérocoques, c'est pas évident, je ne sais pas, mais certaines bactéries sont très très résistantes et il faut extraire avant
effectivement il existe dans la littérature (et dans le commerce) des primers espèce spécifique, par exemple j'ai des primers E. Coli qui détectent coli mais pas d'autres bactéries.
c'est très simple quand on a le matériel, les réactifs et le protocole qui vont bien tous ensemble et que la manip est "au point". Ça l'est beaucoup beaucoup moins quand on part de zéroY'a deux mois, j'ai procédé à une quantification d'ARNm d'une population de E. coli. Je suis pas une pointure dans le domaine mais l'opération est assez simple.
La vie trouve toujours un chemin
Sûr !
Après, s'il est dans une prépa ... peut être qu'ils sont en relation avec des labos ou autres. Perso, les chercheurs que je côtoient acceptent bien volontiers aider donc ... Faut dire que les gens en microbio, y'en a pas tant que çà !
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