RT-PCR et PAGE en conditions dénaturantes???

[chnouks]

bonjour, je suis en révision et j'aurais quelques questions à vous poser.

Pourquoi travaille t on en conditions dénaturantes quand on fait un SDS Page ou sur gel d'électrophorèse pour visualiser de l'ADN??? à quoi servent l'urée et le TBE(on pourrait pas mettre de l'eau osmosée?) lors de la préparation du gel?

deuxième question qui n'a rien à voir: je suis perdu quand on me parle de RT-PCR, PCr en temps réel et PCR q??? RT-PCR c'est pour real time PCR ou c'est pour parler de la Reverse Transcript?? arretez moi je me trompe mais real time PCR et PCR quantitative, c'est bien la même chose?!? enfin bref je suis un peu perdue

Merci d'avance

[Annaick_R]

Bonjour,

que de questions!!! On voit que les exams approchent...

RT-PCR c'est pour real time PCR ou c'est pour parler de la Reverse Transcript??

L'expression "RT-PCR" correspond à une transcription inverse (ou reverse transcription en anglais = RT) suivi d'une PCR.

arretez moi je me trompe mais real time PCR et PCR quantitative, c'est bien la même chose?!?

Oui, c'est la même chose. L'expression entière est : PCR quantitative en temps réel (quantitative real-time PCR en anglais). On trouve plusieurs abbréviations comme qPCR ou PCRq qui sont courantes. En général on évite rtPCR pour éviter la confusion avec la RT-PCR (citée ci-dessus) mais on peut trouver QRT-PCR.

à quoi servent l'urée et le TBE(on pourrait pas mettre de l'eau osmosée?) lors de la préparation du gel?

L'urée je ne sais pas. Quand on fait l'électrophorèse dans du TBE, on utilise du TBE pour faire le gel. Quand c'est dans du TAE, on utilise du TAE pour le gel. Le but de l'opération est d'avoir un maximum de sel dans le tampon pour que le courant passe bien et que l'ADN (chargé négativement) soit attiré vers le pôle positif. Mais, il faudrait vérifier, je ne suis pas trop sûre.

Annaïck.

[mantOs]

Envoyé par chnouks

bonjour, je suis en révision et j'aurais quelques questions à vous poser.

Pourquoi travaille t on en conditions dénaturantes quand on fait un SDS Page ou sur gel d'électrophorèse pour visualiser de l'ADN??? à quoi servent l'urée et le TBE(on pourrait pas mettre de l'eau osmosée?) lors de la préparation du gel?

Pour visualiser de l'ADN par southern blot pas besoin que les condition d'electropherese soit dénaturantes c'est pour le northern que les condition electrophorese sont dénaturantes afin d'éviter les structures secondaires de l'ARNm

L'urée est un agent dénaturant .

[Toll]

Envoyé par Annaick_R

Bonjour,

Oui, c'est la même chose. L'expression entière est : PCR quantitative en temps réel (quantitative real-time PCR en anglais). On trouve plusieurs abbréviations comme qPCR ou PCRq qui sont courantes. En général on évite rtPCR pour éviter la confusion avec la RT-PCR (citée ci-dessus) mais on peut trouver QRT-PCR.

bonjour, une précision,

le terme "PCR en temps" n'est pas exactement synonyme de "Q-PCR" (PCR Quantitative°;

http://ifr-bi.snv.jussieu.fr/Service...eriel_pcr.html
Le premier paragraphe explique bien la PCR en temps réelle.

l'avantage d'une PCR en temps réelle par rapport à une RT-PCR classique est qu'elle va permettre de dire si il y a 2 fois plus; 2,4 fois plus; 13, 8 fois plus d'ARNm dans une conditions par rapport à une autre. quantification relative impossible à faire en RT-PCR (qui te permet de dire: "Il y en a plus, mais combien? 3-4 fois plus, 10 fois plus?).

si pendant ta PCR en temps réelle, tu insère un standard au sein de la manip, tu vas pouvoir être capable de dire le nombre de copies de ton ARNm présent dans le tube: tu arrives à de la quantification abslue, et là, on rentre dans le domaine de la Q-PCR.

en espèrant avoir été clair.

[Yoyo]

Envoyé par mantOs

Pour visualiser de l'ADN par southern blot pas besoin que les condition d'electropherese soit dénaturantes c'est pour le northern que les condition electrophorese sont dénaturantes afin d'éviter les structures secondaires de l'ARNm

L'urée est un agent dénaturant .

Par southern blot en effet, maintenant quand tu fais migrer de l'ADN simple brin tu te mets en présence d'urée afin d'eviter les structures secondaires que l'ADN pourrait former.
Yoyo

[stef néa]

C'est sutout vrai pour la migration d'ADN circulaire, type ADN bactérien, mitochondrial ou encore plasmide. On obtient souvent 2 bandes correspondants à une forme enroulées qui va se faufiller dans le gel, et une bande de plus haut PM apparent. Je ne me rapelle pas avoir utiliser de l'urée pour un northern ou un southern blot ?

[chnouks]

merci pour ces précisions

pour la PCRquanti ou qRT-PCR, j'ai compris.

je récapitule pour le PAGE,

l'urée est un agent dénaturant
le TBE(ou TAE), est utilisé pour les sels et améliore la migration
on travaille en conditions dénaturantes pour éviter que les structures secondaires (ADn ou prot)n'interfèrent dans la migration ou qu'on ait deux bandes au lieu d'une.

corrigez moi si je me trompe