Choix du type de chromatographie et du type de colonne

[invite00dc95c5]

Bonjour,

J'ai un problème en ce qui concerne le choix du type de chromatographie lorsque l'on me donne la structure de deux molécules à séparer. Le cours que j'ai suivi est totalement incomplet pour répondre à ce type de question et les explications sont très limitées.

voici un exemple de question à laquelle il faut répondre...


"Proposez sur un plan théorique un mode de séparation de ces molécules (voir pièce jointe) , un type de colonne et une phase mobile, justifiez votre réponse.

Indiquez l'ordre dans lequel ces molécules seront éluées. Justifiez."

En gros, mon problème se situe dans le choix de la colonne (silice ou colonne plutôt apolaire?) ainsi que dans le solvant (plutôt eau? méthanol? Benzène?) phase mobile? Et pour quelle raison?

Je note que l'on n'a pas vu les chromatographies en phases gazeuse et supercritique.

Merci d'avance, celà m'aiderait énormément...
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[jgiovan]

Un petit coup de main :

as-tu étudié la chromatographie en phase inverse ?

Si oui, la réponse ne devrait pas poser trop de problèmes.

[HarleyApril]

En gros, mon problème se situe dans le choix de la colonne (silice ou colonne plutôt apolaire?) ainsi que dans le solvant (plutôt eau? méthanol? Benzène?) phase mobile? Et pour quelle raison?

Bonjour
Tes molécules diffèrent par leur partie grasse = apolaire
Il te faut donc un support du même type pour que l'interaction permette de faire la différence.
La phase mobile ne sera pas du benzène (toxique et apolaire) mais à base d'acétonitrile ou de méthanol et d'eau
L'eau sera peu éluante, le solvant organique sera éluant. Tu peux donc commencer par un gradiant en diminuant le pourcentage d'eau pour trouver quel sera la composition optimale.
Bien souvent, on n'utilise pas l'eau pure, mais avec de l'acide trifluoroacétique ou une base organique, voire des tampons inorganiques (j'aime moins, si ça précipite, c'est la cata). Peut être qu'avec ça, on sort de ce que tu as vu en cours ?

Cordialement

[invite00dc95c5]

Oui, cela recoupe un peu ce que l'on a vu...(enfin, plutôt ce que l'on a voulu nous faire voir ^^)

On a bien vu la chromatographie en phase inverse, mais on ne nous a pas dit la différence avec celle en phase normale. On nous a juste dit que l'on inverse phase mobile et phase stationnaire.

En gros, pas un mot sur un justificatif de choix de l'un ou de l'autre. C'est ça qui pose problème dans la présentation du cours.

Quand utilise-t-on plutôt une chromatographie en phase inverse et quand utilise-t-on une chromatographie en phase normale?

D'après ce que j'ai compris, dès que l'on a deux molécules qui diffèrent par une partie apolaire (comme dans l'exercice ci-dessus), on doit utiliser une chromatographie en phase inverse
(phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire)

Et dès que l'on a des molécules qui varient par leur partie polaire, on utilise plutôt une chromatographie en phase normale
(phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire)

Corrigez moi si ce que je dis n'est pas juste.

Merci beaucoup

[A voir en vidéo sur Futura]

[jgiovan]

En gros : phase normale = silice, phase inverse = C18 (ou C8).

En phase normale les molécules polaires sont retenues (acides, amines, alcools etc.). En phase inverse les molécules apolaires sont retenues (aliphatiques, aromatiques etc.).

Dans ton cas, les molécules comportent une fonction acide et une partie aromatique et aliphatique importante. Dans la mesure ou la partie hydrophobe est différente pour les 3 molécules, la phase inverse est la plus adaptée.

En utilisant des conditions isochratiques ou un gradient relativement plat tu sépareras aisément tes composés en phase inverse, à condition d'utiliser une phase aqueuse acide pour protoner l'acide comme le suggère Harley. 0.1 % d'acide phosphorique, de TFA, d'acide formique ou acétique devraient faire l'affaire.

La molécule la moins hydrophobe sera éluée en premier car elle sera moins retenue par ta phase inverse.

J'espère que tu es paré maintenant !

En complément, il serait possible de séparer tes 3 acides en phase normale mais ce serait plus laborieux. Un éluant type hexane/acetate d'ethyle ne serait pas suffisant. Il faudrait un peu d'acide acétique et éventuellement de méthanol pour faire passer le tout. Tu n'aurais malgré tout pas une aussi bonne séparation qu'en phase inverse.

[invite00dc95c5]

Je crois que je commence à comprendre.

Vous me sortez d'une belle impasse.

Merci et bonne journée à vous

[invitefe49e2a0]

Oui, cela recoupe un peu ce que l'on a vu...(enfin, plutôt ce que l'on a voulu nous faire voir ^^)

On a bien vu la chromatographie en phase inverse, mais on ne nous a pas dit la différence avec celle en phase normale. On nous a juste dit que l'on inverse phase mobile et phase stationnaire.

En gros, pas un mot sur un justificatif de choix de l'un ou de l'autre. C'est ça qui pose problème dans la présentation du cours.

Quand utilise-t-on plutôt une chromatographie en phase inverse et quand utilise-t-on une chromatographie en phase normale?

D'après ce que j'ai compris, dès que l'on a deux molécules qui diffèrent par une partie apolaire (comme dans l'exercice ci-dessus), on doit utiliser une chromatographie en phase inverse
(phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire)

Et dès que l'on a des molécules qui varient par leur partie polaire, on utilise plutôt une chromatographie en phase normale
(phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire)

Corrigez moi si ce que je dis n'est pas juste.

Merci beaucoup

Concernant l'HPLC, le Phase inverse est la plus utilisé car elle préente un champs d'application plus large que la phase normale... je pense qu'avant tout tu dois bien comprendre pourquoi normal et inverse... historiquement la chromatographie se faisait sur la silice (phase stationnaire plutot polaire) et un éluant constitué d'un mélange peu polaire (avec majorité d'hydrocarbures)
pour la phase inverse, on dit inverse car les polarités sont inversés (pas les phases...) ainsi en phase inverse, la phase stationnaire et plutot apolaire et l'éluant est polaire (mélange solvants avec eau, MeOH, Acétonitrile, ...)...
ok pour la polarité des phases ?....

Donc quand utilisé l'un ou l'autre... ben c'est une question autant un question lié à la solublisation de tes produits dans l'éluant que la question de discrinmination. En phase normal, les molécules doivent solubles dans des éluants à majorité d'hydrocarbures... (c'est pas les meilleurs solvants...)
En phase inverse, tes solvants c'est le Méthanol, l'eau ou l'acétonitrile... de bien meilleurs solvants avec infiniment moins de risque de recristallisation.
En phase normal les prdts polaires seront fortement retenu et les apolaires seront vite élué... si tes produits sortent trop vite tu risques de ne pas pouvoir les séparer... donc passe en phase inverse.... et si tes produits sont trop polaires tu risques de trop les retenir.... donc phase inverse... en phase inverse en générale on gère bien mieux l'élution...

Donc le choix dépend de ta molécule à analyser et sa polarité

ton histoire de molécule qui vari... je ne comprend pas et je crainds que tes profs non plus... c'est la polarité de ta molécule et sa solubilité dans l'éluant qui feront que tu utilises l'un ou l'autre.
Maintenant dans la vrai vie de chromatographiste, les applications en phases normales sont souvent lié à l'usage de chromatographie Chirales....
très souvent les autres applications sont en phase inverse...

Enfin pour finir nous n'utilisons pas d'acétate d'éthyle en phase normale (ou extrêmement rarement) car il absorbe trop en UV (détecteur le plus répendu) et donc "opacifie" ton signal...
le méthanol peut êre utilisé mais dans des proportions particulièrement limitées car il n'est miscible dans l'Hexane qu'à moins de 5%environ...
l'alcool le plus utilisé en phase normal avec l'hexane est l'isopropanol ou l'éthanol (mais à >20% pour les mêmes raisons). l'Hexane tant à disparaitre en raison de sa neurotoxicité.
sinon je partage l'anaylse de jgiovan

bonne journée
à plus

[cephalotaxine]

En phase normal, les molécules doivent solubles dans des éluants à majorité d'hydrocarbures... (c'est pas les meilleurs solvants...)
En phase inverse, tes solvants c'est le Méthanol, l'eau ou l'acétonitrile... de bien meilleurs solvants avec infiniment moins de risque de recristallisation.
En phase normal les prdts polaires seront fortement retenu et les apolaires seront vite élué... si tes produits sortent trop vite tu risques de ne pas pouvoir les séparer... donc passe en phase inverse.... et si tes produits sont trop polaires tu risques de trop les retenir.... donc phase inverse... en phase inverse en générale on gère bien mieux l'élution...


Enfin pour finir nous n'utilisons pas d'acétate d'éthyle en phase normale (ou extrêmement rarement) car il absorbe trop en UV (détecteur le plus répendu) et donc "opacifie" ton signal...

C'est un peu général quand même... perso, pour les chromato classiques, j'utilise une phase normale 9 fois sur 10... pour les problèmes de solubilités, il y a le DCM et les dépots solides
Quant à l'eau, l'acétonitrile ou le MeOH, il y a une multitude de cas où ces derniers entrainent une précipitation du mélange à purifier... pas terrible non plus... bref, il faut faire des CCM dans tous les cas (phase normale et inverse), tester les éluants et choisir ensuite.
Enfin pour AcOEt, je n'ai jamais vu d'interférence avec la détection UV.

[invitefe49e2a0]

C'est un peu général quand même... perso, pour les chromato classiques, j'utilise une phase normale 9 fois sur 10... pour les problèmes de solubilités, il y a le DCM et les dépots solides
Quant à l'eau, l'acétonitrile ou le MeOH, il y a une multitude de cas où ces derniers entrainent une précipitation du mélange à purifier... pas terrible non plus... bref, il faut faire des CCM dans tous les cas (phase normale et inverse), tester les éluants et choisir ensuite.
Enfin pour AcOEt, je n'ai jamais vu d'interférence avec la détection UV.

Dans le cas présent, il s'agit visiblement de chromato analytique donc :
L'AcOEt absorbe bcp en UV.. de faite la DO en prend un coup et tu te retrouve avec un mauvais signal sur bruit.... en flash je sais que c'est utilisé mais pas en analytique... ceci dit amusez vous, vous verrez...

enfin, la phase normal n'est pas connu pour être particulièrement répendu en analytique en raison des pbs de solubilité... je ne partage pas ton analyse sur la phase inverse dont le champs d'application est nettement plus développé que la phase normal... moi aussi j'utilise la phase normal 9 fois sur 10 car je fais de la chromato chirale... mais en dehors de ce contexte très spécifique les phases inverses sont nettement plus propice et plus vaste en terme d'applications... en plus on peut davantage jouer sur les diffrentes colonnes de phase C18 ou cyano, ou autres...
les dépots solides : dois je vraiment répondre... as tu fait de l'analytique avec du dépot solide.?.????
c'est pas évident... en prépa ou flash d'accord, mais pas en analytique...

########on critique les idées, pas les personnes########
au plaisir....

[HarleyApril]

le lecteur attentif aura compris que Céphalotoxine répond sur de la chromatographie préparative à faible pression et non sur des techniques HPLC
d'où la grosse divergence des réponses qui est tout à fait logique

cordialement

[cephalotaxine]

Dans le cas présent, il s'agit visiblement de chromato analytique donc :
L'AcOEt absorbe bcp en UV.. de faite la DO en prend un coup et tu te retrouve avec un mauvais signal sur bruit.... en flash je sais que c'est utilisé mais pas en analytique... ceci dit amusez vous, vous verrez...

enfin, la phase normal n'est pas connu pour être particulièrement répendu en analytique en raison des pbs de solubilité... je ne partage pas ton analyse sur la phase inverse dont le champs d'application est nettement plus développé que la phase normal... moi aussi j'utilise la phase normal 9 fois sur 10 car je fais de la chromato chirale... mais en dehors de ce contexte très spécifique les phases inverses sont nettement plus propice et plus vaste en terme d'applications... en plus on peut davantage jouer sur les diffrentes colonnes de phase C18 ou cyano, ou autres...
les dépots solides : dois je vraiment répondre... as tu fait de l'analytique avec du dépot solide.?.????
c'est pas évident... en prépa ou flash d'accord, mais pas en analytique...

########on critique les idées, pas les personnes########
au plaisir....

comme le dit Harley April, je parle d'utilisation de l'AcOEt dans les chromato préparatives, elles sont couplées chez nous à une détection UV, mais on fait le blanc sur l'éluant utilisé et du coup il n'y pas d'interférence avec la détection. Sur HPLC, c'est clair que sur un échantillon comportant un peu l'AcOEt on récupère un pic en début de run.
Pour le choix des phases en HPLC, c'est clair que la phase inverse est largement plus répandue, notamment en HPLC analytique. Les choses se corsent en HPLC préparative, nous on utilisons beaucoup la phase inverse, mais on fait pression pour que les fournisseurs nous préparent aussi des colonnes équipés en phase normale car sur certains de nos produits, des problèmes de solubilité nous empêchent parfois de travailler en phase inverse. La phase normale nous a parfois rendu de grands services dans ce genre de cas. (avec utilisation de l'AcOEt comme éluant, sans pb visiblement)
Dernier point, dans le cas d'un appareil MDAP (Mass Directed Auto Prep) utilisé en libre service par les chimistes, l'avantage de la phase normale serait de pouvoir directement transposer les constatations issues de la CCM au choix du gradient HPLC... mais c'est encore en développement
Bref... pleins de possibilité avec la chromato... à choisir judicieusement selon le cas