Dosage de la taurine par HPLC

[mv1993]

Bonjour,

Je suis actuellement en train de travailler sur une méthode de dosage de la taurine par HPLC.

Ce dosage nécessite une étape de dérivatisation rendant la molécule de taurine détectable à l’UV-Vis.

Je travaille avec l’aide de publications, voilà le résumé pour que vous compreniez mieux ce dosage :

Le but de la dérivatisation est d’introduire dans la molécule de taurine, un chromophore permettant sa détection à l’UV-Vis.
Pour l’étape de dérivatisation j’ai besoin du réactif de Sanger, le 2,4-dinitrofluorobenzène (DNFB). Ce réactif va réagir avec le groupe terminal amino de la taurine pour former un dérivé de dinitrophényle, le DNP-taurine qui est de couleur jaune vif présentant une absorption d’environ 360 nm. Il faut que le pH soit suffisamment élevé pour que le groupe amino ne soit pas protoné mais suffisamment bas pour que le DNFB ne réagisse pas directement avec l’hydroxyde de la soude sinon le 2,4-dinitrophénol sera formé et celui-ci présente également une absorption à 360 nm. Un pH de 9 suffit pour la réaction de la taurine.

Voici le déroulement de l’étape de dérivatisation :

Ajouter dans un tube à essais 1 mL de standard + 2 mL de tampon carbonate à pH 9 (permets à la réaction d’avoir lieu) + 0,5 mL de DMSO (catalyseur, accélère la réaction) + 0,1 mL de DNFB (permets de rendre la molécule de taurine détectable à l’UV-Vis).
Ensuite agiter 30 sec puis chauffer au bain marie pendant 15 min à 40°C.
Enfin ajouter 6,5 mL de tampon phosphate à pH 6.

De plus voici ma méthode HPLC pour ce dosage :
Solvants : tampon phosphate pH 6 / Acétonitrile 80 :20.

Mes questions sont pourquoi doit-on ajouter du tampon phosphate à pH 6 de la phase mobile dans mon étape de dérivatisation ? Serait-il pour stopper la réaction ?
Et savez-vous pourquoi le bain marie doit être aux alentours des 40 °C ?

Merci
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[sfnsfn2]

Bonjour,
l'ajout du tampon phosphate a pour but de solubiliser la solution à injecter dans un solvant plus proche de la composition de la phase mobile pour faciliter l'équilibre et l'obtention d'un pic symétrie (ce que je pense).
- Pour le choix du temps et la température de la réaction, et même les concentrations, tu dois trouver dans les publications, et surtout l'originale, tous les étapes d'optimisation des conditions de la réaction: les chercheurs essayent plusieurs conditions et ils traces les surfaces des pics en fonctions des paramètres pour trouver à la fin les meilleurs conditions en tenant compte de la stabilité du composé et les réactions secondaires.