bonjour à tous,
voila je cherche à réaliser le clonage d'un grand fragment de PCR, 4kb. quelqu'un aurait il une idée pour m'aiguiller. Nous avons deja testé différentes choses mais sans aucun résultat malheureusement. Nous sommes ouverts à toutes propositions réalisables.
Merci
4 kb ça rentre dans du PCDNA3 en E. coli normalement...
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
on a tenté de cloner dans pEGFP car on veut faire une fusion de notre gène à la GFP
Comment avez vous tenté le clonage?
Avec une polymérase spéciale?
Avec digestion après la PCR pour avoir les extrémités compatibles avant ligation dans le plasmide GFP?
Y a t'il un bon rendement après PCR, l'ADN est-il purifié par PCR purification kit ou équivalent?
J'ai fait pas mal de clonage de gros fragments, issus de PCR dans parfois de très gros plasmides, et parfois des plasmides arrangés maison (un bon vieux bluescript avec un oligo pour ajouter des cassettes GFP et un MCS), je n'ai pas eu de trop gros problèmes, à part murphy...
Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.
Slt, alors oui amplification avec bon rendement du fragment désiré. purification ok avec un bon rendement égalment. Ensuite on a digéré le fragment PCR et notre plasmide avec les memes enzymes. On a testé différentes choses mais rien n'y fait. On n'obtient pas de clones satisfaisants
On a utilisé la Pfu.
Parfois c'est la ligation qui merde : tenter davantage de rationes plasmides/insert (?)
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
Salut,
Le clef c'est la qualite de la digestion. Le mieux (et de tres loin d'apres mon experience) c'est de faire tes digestions une seule enzyme a la fois, dans 50 ul final, en utilisant au maximum 40 u d'enzyme (pas plus de 2 ul) et en incubant 2-3h a la temperature indiquee par le fabricant. Ensuite, une purif et la meme chose avec la 2 eme enzyme, puis Re-purif, puis ligation O/N (perso j'utilise pas plus de 20 ng de plasmide avec un ratio compris entre 3/1 et 10/1).
Toujours faire un control de ligation plasmide sans insert, puis l'electroporer en meme temps. Si tu n'as pas au moins un facteur 10 entre ton control et ton essais, c'est que ton vecteur est mal coupe. Dans ce cas ne perd pas de temps a screener 200 colonies, jette ta ligation, reprend ton plasmide "digere" et recoupe le une nouvelle fois.
Sauf dans le cas d'un insert toxique, ca devrait marcher !
A+
et bien je te remercie beaucoup pour toutes ces informations. Nous avons enfin obtenu un clone qui semble correct. toute fois je garde précieusement ce que tu m'as dit en réserve au cas où le séquencage nous réserve encore des surprises.
Merci
bad news !!!
Le clone obtenu n'est pas un plasmide avec mon insert. Je tenais qd meme a vous remercier des messages que vous avez laissé a mon intention
