Race Pcr

mimosa · 07/12/2005, 22h02

Je craque ça fait presque trois mois que j'essaie de cloner l'extrémité 5' d'une enzyme par race pcr (environ 150 pb) et une fois que je reçois la séquence de mon clone je retrouve la séquence de l'anchor primer accolée à celle de mon amorce spécifique.
Qui peut m'aider quelqu'un a déjà rencontré ce problème ou a une autre solution pour cloner l'ext 5'?
PS: j'utilise le kit 5'/3' RACE de Roche.

Merci d'avance

flashman · 08/12/2005, 18h12

Il peut y avoir beaucoup de cause à ton problème, c'est l'inconvénient de la PCR. Il est donc difficile de t'apporter une aide. Si j'ai bien compris tu amplifie tes amorces au lieu d'amplifize ta séquence c'est bien ça?

Noun · 08/12/2005, 18h54

\Salut,
A mon avis, il faut tester plusieurs amorces specifiques differentes et bien d'utiliser une amorce decalee pour la deuxieme PCR (plusieurs differentes). A part ca, ton probleme peut peut etre etre resolu par une bonne purification apres le traitement a la terminal deocynucleotidyl transferase.
Tu peux aussi bien sur augmenter la temperatue d'appariement.
Sinon, pose ta question sur le web de Roche, ils repondent vite
Noun