clonages

[inviteb38fc7ba]

Bonjour,

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques? Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide? Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques. Une autre question pour améliorer mes clonages est: quelle quantité de plasmide faut il mettre dans le mix de ligation...j'ai pris 100ng de plasmide avec un rapport plasmide/insert d'environ 1/3 et 1/5.

Je me renseigne pour avoir des conseils au cas ou je n'obtiendrai pas de clones pour les clonages que j'ai commencé.

merci d'avance à ceux qui me donneront des conseils pour tenter au mieux de cloner.
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[invite94612525]

Salut,
pour la premiere question, ca depend des tampons utilisees pour les deux enzymes. Si ils ont compatibles (cf catalogues du distributeur), pas besoin de purifier, on peut meme metre les deux enzymes ensembles.
Pour la deuxieme, bien sur, il faut debarasser l'insert et le plasmide de l'enzyme de restriction avant la ligation. et une purification me semble plus sure q'une inactivation par la temperature
Il faut aussi dephosphoryler le plasmide avant ligation

Pour bien purifier, si t'as pas de kits (ou si tu n'en utliise pas par principe), je conseil un phenol/chloro avant la precipitation. et bien faire le lavage a lethanol 70% apres precipitation

Dans la mesure du possible, il faut eviter la purif sur gel car ca fait perdre de l'insert et le bromure d'thidium et les UVs risquent d'abimer l'ADN. EN plus en general (si les digestion sont bien faites), ca ne sert rien du tout(c'est nefaste selon mon experience)

50-10 ng c'est bien, mais le point crucial est souvent la qualite des bacteries competentes qui varie beaucoup et peut etre testee avec un plasmide controle. Electrocompetentes,, c'est le mieux. Si tu les faits toi meme, resuspend les tres concentree a la fin
Bonne chance
Noun