Compatibilite quintuple immunomarquage

[invite81b669fe]

Bonjour a tous.

je souhaiterais faire un quintuple marquage en immunostaining, il me faut donc une bonne compatibilite pour les anticorps, pour ne pas qu'il y ait de chevauchements dans les longueurs d'onde.

Dapi pour le noyau, ainsi que FITC sont fixes, il ma faudrait donc 3 autres couleurs bien distinctes. Pouvez vous me dire si je peux prendre du Jaune et du rouge ou bien c'est trop [proche et je ne verrai pas vraiment de difference.

J'ai donc le bleu(violet, UV) de fixe, le vert (FITC), je peux prendre le rouge, le jeune peut etre si cest pas trop proche mais apres je vois pas trop.

Est ce que les quintuples marquages sont possibles ?

Qvez vous des conseils la dessus. N'inporte quoi je suis preneur.

Merci.

Bonne journee.
-----

[Jean-Luc P]

Tu peux prendre deux rouges : alexa 568 et CY5, ou Cy3 et cy5 (ou deux alexa compatibles il y en a tellement....).

Le jaune pas compatible avec FITC.

Pour la cinquième couleur plus problématique, le DAPI bavant beaucoup... Alexa 405 ???

[invite81b669fe]

Merci pour ta reponse.

Ceci dit, es tu sur pour les deux rouges ? Est ce que je pourrai bien les differencier ?

Oui pour le dapi tu as raison, je vais voir ce que je trouve en UV ou vers les 400nm.

Donc selon toi le jaune ne serait pas compatible ?

Derniere chose, je vais essayer autant que possible de prendre des anticorps deja conjugue pour eviter les secondaires, penses tu que je vais trouver ca sans probleme ?

Merci encore.

[invite9eab997a]

Derniere chose, je vais essayer autant que possible de prendre des anticorps deja conjugue pour eviter les secondaires, penses tu que je vais trouver ca sans probleme ?

Merci encore.

Ca depend sur quelle espèce tu travailles! Sinon, tu peux faire tes couplages toi meme, il y a des kits exprès. Un peu chiant, mais si tu n'as pas le choix...
Pour le noyau j'utilise du Topro3 (interdiction d'utiliser le DAPI au confocal ). Ca émet dans le rouge profond, limite IR.
Et enfin, une petite question pour Jean-Luc P: j'ai entendu dire que l'alexa488 était plus stable et moins "baveux" que le FITC. Aurais tu des infos la dessus?
Merci.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite81b669fe]

Ca depend sur quelle espèce tu travailles! Sinon, tu peux faire tes couplages toi meme, il y a des kits exprès. Un peu chiant, mais si tu n'as pas le choix...
Pour le noyau j'utilise du Topro3 (interdiction d'utiliser le DAPI au confocal ). Ca émet dans le rouge profond, limite IR.
Et enfin, une petite question pour Jean-Luc P: j'ai entendu dire que l'alexa488 était plus stable et moins "baveux" que le FITC. Aurais tu des infos la dessus?
Merci.

Ok, merci. Par contre j'utilise le DAPI au confocal, c'est une regle interne ou c'est mal de faire ca ?

Et puis je prefere acheter directement les anticorps conjugues tant qu'a faire.

[invite9eab997a]

non c'est une règle interne: ni Hoechst ni dapi.
En ce qui concerne les conjugués, chez le rat j'ai été obligée de les marquer moi meme car quand on fait du 7 couleurs, tu es limité quant au choix des fluorochromes. Mais je te souhaite de trouver ton bonheur dans les catalogues

[invite81b669fe]

Ah ok 7 couleurs effectivement... Comment tu te debrouilles dans ce cas la ? Tu prend un fluorochrome tous les 50nm ?

Edit : Jaimerais bien savoir aussi l'ecart de longueur d'onde necessaire a la bonne separation de deux signaux. Est ce 50nm, 75, 100.

Merci.

[Jean-Luc P]

Et enfin, une petite question pour Jean-Luc P: j'ai entendu dire que l'alexa488 était plus stable et moins "baveux" que le FITC. Aurais tu des infos la dessus?
Merci.

Stabilité, je pense oui.

Baveux par contre je n'ai pas l'impression.

Si le DAPI émet vers 800-850 ça peut ne pas être compatible avec Cy5... A vérifier donc...

Sinon pour els deux rouges oui ça marche bien à condition d'avoir les bons filtres ou les bonnes raies laser ! (Au pire déconvolution spectrales ils sont assez robustes ces deux-là).