Immunohisto

[inviteaac93371]

Bonjour, j'étudie l'immunohistochimie et je voudrais avoir quelques renseignements...
Lors des étapes de l'immunohisto plusieurs procédés m'échapent...
Le premier, lors de la fixation et de l'inclusion dans la paraffine est l'incubation dans le PFD (Paraformaldéhyde) quelqu'un sait-il à quoi sert cette étape exactement?
Ensuite lors des étapes de déshydratation... à quoi sert cette étape? (C'est avec du méthanol de concentration croissante puis l'incubation dans de l'isopropanol et du xylène...) à quel niveau agissent ces différents alcools?
Merci beaucoup
Lio
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[invite200aa768]

Le paraformaldehyde (PFA) sert a fixer ton echantillon. C'est un fixateur chimique, un agent pontant, qui va creer des liens covalents entre les proteines en particulier entre les amines libres. L'interet est multiple: 1-l'echantillon, le tissu, reste dans l'etat ou tu l'a fixe l'histologie et la cytologie sont conserves, 2-il n'y a plus degradation des elements cellulaires donc les antigenes a detectes sont preserves, 3-le tissus peut etre plus facile a couper si tu le fixe avant la coupe...

(mais attention, la fixation au PFA peut aussi masquer les epitopes a detecter et produit de l'autofluorescence quand on fait de l'immunofluorescence, ce qui ne semble pas etre ton cas)

Pour le xylene et la deshydratation, desole, m,ais je fais de la fluorescence depuis 6 ou 7 ans, mais je n'ai jamais fait d'immunohistochimie en DAB...je ne monte pas en xylene et je n'ai pas donc de reponse a cette question...

[inviteaac93371]

Merci beaucoup rodago! Personne n'a d'idée pour la déshydratation??
Merci d'avance
Lio

[inviteffc67642]

J'ai trouvé un petit lien là dessus :

There is a difference between dehydrating and drying. Dehydration is an active removal of water molecules while drying is a passive process that brings the tissue to equilibrium with the environment. The presence of water within the tissue sample will not allow proper wetting of the transfer film or good capture of the cell.

Proper dehydration entails the use of graded ethanols. A final 100% ethanol step is of great importance, but it will only be effective if 100% ethanol that has been freshly dispensed is used. Due to the hydroscopic nature of ethanol, moisture from the air can hydrate the 100% ethanol, making it less effective as a dehydrating agent. Xylene incubations will completely remove ethanol and water remnants from the sample. Air drying of the slides will remove the xylene from the sample; however, the xylene must be completely evaporated. Although a sample may appear completely dehydrated after a short drying period, xylene may still remain. To ensure complete dehydration, a slide should typically be air dried for a minimum of 5 minutes under a fume hood. If the humidity of the laboratory is an issue, such as during summer months of tropical environments, the drying ca take place within a vacuum desiccator. Also longer exposure to fresh 100% ethanol and xylene have shown to aide in the transfer efficiency.

Ca explique un peu les différentes étapes et leur pourquoi...
Après, cela ne répond peut être pas à tes questions.
Mais comme Rodago, je n'ai jamais eu recours à cette méthode pour mon histo...

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteea6fd0dc]

Bonjour,

En histo, la déshydratation en remontant les alcools sert tout simplement à éliminer la moindre trace d'eau, puis à passer dans le xylol. Le xylol est un dissolvant de la paraffine, l'alcool non (ni l'eau ferrugineuse j'ai pas pu m'empêcher )
Le problème est que le xylol n'accepte pas la moindre trace d'eau.

Il y a des méthodes alternatives, avec des dissolvants qui acceptent et des traces d'eau et qui dissolvent la paraffine. Méthode à l'acétone, au trichloréthylène par exemple.

Le principe est toujours le même, pour inclure à la paraffine il ne faut plus la moindre trace d'eau d'où le terme déshydratation

Amicalement

[invite200aa768]

Et ben voila...

[inviteaac93371]

Merci beaucoup!! J'ai tout compris
A bientôt
Lio

[piwi]

Sinon la fixation à la PFA est un abus de langage. La PFA c'est la poudre. On parle de solution PFA 2%, 4%... Mais en fait la PFA en solution forme tout bêtement du formol. Donc la fixation à la PFA est une fixation au formol.

Cordialement,
piwi

[invite8a563c47]

Bonjour,
J'ai également une question qui concerne l'immunohisto, je voudrais savoir s'il est possible qu'il n'y ait pas du tout de marquage en immunohistochimie dans une structure X, alors qu'il y en a par analyse western blot? Et si c'est le cas, comment peut-on l'expliquer? Car si c'est un problème de sensibilité, je ne vois pas pourquoi d'autres structures Y seraient marquées, mais pas la structure X?
Merci de bien vouloir m'aider....
http://forums.futura-sciences.com/im...ilies/help.gif

[invite200aa768]

Bonjour,
J'ai également une question qui concerne l'immunohisto, je voudrais savoir s'il est possible qu'il n'y ait pas du tout de marquage en immunohistochimie dans une structure X, alors qu'il y en a par analyse western blot? Et si c'est le cas, comment peut-on l'expliquer? Car si c'est un problème de sensibilité, je ne vois pas pourquoi d'autres structures Y seraient marquées, mais pas la structure X?
Merci de bien vouloir m'aider....

Bonjour,
il y a plusieurs explications possibles.

L'anticorps peut +/- bien marcher en western-blot par rapport a l'immunohisto (ou cyto-)-chimie. Les tampons sont differents, les conditions aussi...l'interaction epitope-site anticorps etant conditionne grandement par des interactions ioniques-electrostatiques, les tampon, pH, ions (...) jouent pas mal.

Par ailleurs, l'anticorps peut reconnaitre des structures +/- natives ou bien denaturees. En immunohistochimie, l'antigene est (normalement, et si l'on considere la fixation comme preservatrice) en conformation native. les proteines gardent une structure secondaire, tertiaire ou meme quaternaire. Les anticorps peuvent alors reconnaitre des epitopes conformationnels (par exemple, un motif d'acides amines regroupes spatialement mais eloignes sur la sequence, ou bien des boucles...). Cette structure spatiale n'a pas forcement la meme forme en fonction du tissu, puisque la proteine cible n'est pas forcement la meme exactement (glycosylation, phosphorylation, acylation...etc...).

En western-blot, c'est le plus souvent la proteine denaturee qui est detectee (a condition de faire un western denaturant: avec SDS et b-mercaptoethanol entre autre). Il n'est donc plus question d'epitope conformationnel...

Cependant: 1) en western, si l'anticorps est suppose reconnaitre un site qui peut etre modifie (phosphoryle, clive, episse, acetyle, palmytoyle...), il se peut que en fonction du tissu, la proteine soit ou non modifiee a cet endroit et donc ne lie plus aussi bien l'anticorps en western-blot...2) il est naif de croire qu'en western denaturant on denature completement, on garde certaines interactions proteiques (oligomeres, structures secondaires...etc...) donce le site antigenique peut etre masque en western aussi...


Voila, j'espere que ca aide un peu.

[invite8c0cc995]

pour compléter rodago, j'ajouterai que la fixation peut aussi induire un masquage de ton antigène, ce qui peut nécessiter des étapes dites d'"antigen retrieval" à la chaleur, ou avec des protéases.
En immunohisto il faut utiliser les anticorps beaucoup plus concentrés qu'en western blot.
Enfin, il faut aussi mettre des contrôles positifs dans la manip (tissu ou l'on sait que l'on va avoir un marquage, lame avec un autre anticorps primaire, mais utilisant le même secondaire, pour éliminer un problème avec le substrat chromogénique, ...)

[invite8a563c47]

Merci pour ces renseignements, mais je crois qu'il y a quiproquo à propos du terme "structure"; quand je dis structure, c'est pour parler de zone du tissu et non pas conformation de la protéine. Donc je repose mon problème en essayant d'être plus clair:

Comment expliquer que mon anticorps (spécifique de l'état phosphorylé d'une protéine) se fixe sur le tissu cérébral dans une structure Y (donc il marche!), mais pas dans la structure X (y a rien du tout de marquer!) où l'on observe du marquage en western avec le même anticorps?

[piwi]

Bonjour,

Il peut y avoir plusieurs explications.
Votre protéine peut avoir des interactants en Y qu'elle n'a pas en X entainant masquage des épitopes et/ou changement de conformation par exemple.

Cordialement,
piwi