Ligation
Bonjour,
J'ai un insert de 162bp (produit de PCR digéré par BamHI puis purifié) que je veux ajouter a un vecteur par ligation. Afin de verifier que ses extremites sont OK, je l'ai ligué a lui meme. Je m'attendais a voir une belle échelle sur gel d'agarose, mais je ne vois qu'un smear...
A votre avis, c'est normal ou pas :?
Exup
J'ai déjà obsrevé des échelles sur des ligatures où j'avais un peu forcé en inserts, donc oui tu devrais voir au moins des dimères trimères...
En général un smear coorespond soit à une dégradation, soit à de la présenec d'adn génomique coupé mécaniquement...
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
Salut,
Sans vouloir etre mechant, quitte a faire une ligation pourquoi ne pas l'avoir faite avec le plasmide????? Tu aurais vite vu si ton produit etait bien digere ou non. De plus, la majorite des problemes viennent d'un plasmide mal digere, et non d'un insert mal digere.
Maintenant, desole mais je n'ai aucune idee pour le smear aux petites tailles (aux grandes tailles, c'est normal c'est du a la resolution du gel)
A+
Salut
en theorie tu ne devrais pas voir de smear, maintenant avec les sels de la ligation... mais en tout cas je suis d'accord avec gorben, quite a tester j'aurai pris un puc19 digéré par BamHI et j'aurai regardé le nombre de colonies blanches en présence de xgal
YOyo
Et d'IPTGEnvoyé par Yoyo
J'ai des problemes de ligation dans le vecteur justement !, c'est pour ca que je teste chaque partie separement... mais merci quand meme pour la suggestion ;o)
hum, tu a verifié ta purif ?
J'ai tout vérifié avant ligation. Tout a ete purifie et reverifie sur gel. Le vecteur se ligue sur lui meme avant dephosphorylation et pas apres, donc en theorie les extremites sont ok. Idem pour l'insert qui semble etre ok aussi (des personnes de mon labo m'ont dit que le smear etait normal quand on ligue un produit des produits de pcr seuls). A priori tout semble ok... sauf que maintenant je me demande si ca ne serait pas la dephosphorylation du vecteur qui serait trop poussee... faut que je teste des temps d'incubation avec la SAP plus courts... pfff
Au fait, dans tes amorces de PCR tu as bien pensé à rajouter deux nucléotides en 5' car sinon l'enzyme de restriction risque de ne pas couper sa séquence...
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
salut
sur ce genre de manip c'est souvent la digestion du produit de PCR qui s'effectue mal. en effet les enzyme ont des difficulté pour coupes aux extremites un fragment d'ADN linéaire.
Moi ce que je fais dans ce genre de cas, c'est que je passe par une etape de sous clonage dans un vecteur type pBC (resistance chloramphenicol) je ressort l'insert par les enzymes et je clone dans mon vecteur final (resistant ampi). Les differences de resistances m'empeche d'avoir des problemes de contamination d'un vecteur par un autre
YOyo
salut
j'ai eu le meme probleme il n'y a pas longtemps avec un insert de 7 kb (oui 7000 pb !). Je suis passé par un vecteur de sous clonage type TOPO TA cloning et je l'ai ressorti et cloné nickel. C'etait donc bien un probleme de digestion de mes fragments au départ (malgré les nucléotides supplémentaires rajoutés lors du design en 5').
Attention a la dephosphorylation, ca abime les extremite de ton vecteur et ca le rend difficile a liguer.
Perso dans un cas comme le tient je coupe le vecteur jusqu'a ce qu'il ne reste plus de circulaire et ensuite je dephosphoryle les inserts (juste le temps indique dans le protocole) puis ligation avec un ratio 20:1 ou 50:1 (insert:vecteur).
Avec autant d'inserts ton plasmide aura du mal a se liguer sur lui meme, et dephosphoryler les inserts evite d'avoir des multimeres...
A+
Bonsoir tout le monde,
Je tombe ici un peu par hasard... Cependant, c'est en cherchant ce qui me bloque dans mon travail que je suis tombée sur cette discussion...
Peut être que l'un d'entre vous pourra m'aider.
Celà fait 4 bons mois que je travaille sur un clonage... je suis complètement désespérée.
Mon vecteur est déjà le résultat d'un précédent clonage. Mon but est d'enlever une partie et d'y mettre un insert à la place.
Le vecteur digéré et dépourvu du morceau que j'enlève, fait environ 8Kb et mon insert 3Kb... Je sais que ce sont de grandes tailles mais ce n'est pas limitant m'a t'on dit.
Je digère en deux étapes le plasmide avec SpeI et SacII (je déphosphoryle vers la fin de la deuxième digestion en ajoutant CIAP) et je l'extrait du gel, je le purifie. (j'ai tout vérifié et ai essayé par digestions croisées) Le plasmide semble apte à recevoir l'insert.
Pour ce qui est de l'insert... Je réalise une PCR avec primers modifiés, c'est à dire que j'ai ajouté le site de restriction à une extrémité du primer. Le produit de PCR a été cloné dans TOPO pour faciliter la digestion des extrémités (vérif par séquençage). En fait je digère avec XbaI (qui se liguera à SpeI en perdant le site de restriction donc) et avec SacII pour l'autre extrémité... Après digestion, extraction sur gel et purification, je procède à la ligation... et à mon avis le problème c'est ça...
J'ai essayé les ligations 1h à T°C ambiante, plus d'une heure à T°C ambiante et Overnight dans une boîte en frigolite avec des cylindre en métal placés en chambre foide... les cylindres en métal permettraient de passer par différents paliers de température pour optimiser la ligation... je fais toujours un gel pour comparer les intensité plasmide/insert et mettre 3x plus d'insert que de plasmide...
Soit, Après ligation et transformation dans des cellules competente de E coli, je récupère mes colonies et fais mes PCR de vérification... Et là, rien... Le désespoir total...
Donc, en lisant ce post, je me demandais si ce serait bien d'essayer de déphosphoryler plutot l'insert??? Ou si vous avez d'autres remarques, elles sont les bienvenues...
Je suis désolée pour le roman mais bon, c'était pas facile à expliquer...
Bonne soirée et à bientôt...
Y-a-t-il du BET dans votre gel? Parce que ça c'est assez rédhibitoire.
Une solution:
Faire migrer un aliquote à coté du reste de votre préparation dans un gel sans BET. Couper la bande avec l'aliquote et la post-colorer au BET. Localiser votre bande, reconstituer votre gel et couper la bande non colorée au BET.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Juste pour donner quelques nouvelles,
J'ai réussi à obtenir ma construction.
J'ai tout fait sans passer par extraction sur gel, donc plus de BET ni d'effet des UV... J'ai obtenu un seul clone positif sur une soixantaines de clones testés... C'est pas beaucoup mais c'est suffisant!
Merci pour l'aide apportée!
1 an et 1/2 pour 1 construction donc
Mon "record" est de 9 mois
Mais non.
La question de Kaliazur a été posée il y a un peu plus de 1 mois. T'es bien le recordman (et moi qui m'étais trouvé long avec deux mois; me voilà réconcilié avec moi même)
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Mince, désolé. Je suis excusé, c'était un clonage non prioritaire et donc fait en pointilléMais non.
La question de Kaliazur a été posée il y a un peu plus de 1 mois. T'es bien le recordman (et moi qui m'étais trouvé long avec deux mois; me voilà réconcilié avec moi même
Bien tenté mais ca passe pas
T'as le record et puis c'est tout!
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Pour les sous-clonages que je suis en train de réaliser, cela fais un moment que j'ai abandonné l'extraction sur gel qui, pour toi aussi apparemment t'as porté préjudice. Maintenant je suis passé sur un PCR extraction kit qui permet de se débarasser des enzymes de PCR ainsi que de restriction et de la phosphatase alkaline, par un système de colonne. Rapide, simple, fiable, je le recommande à quiconque se lance dans un clonage/sous-clonage.
Greg
Pour ma part ça fait 5 mois...
Mais c'était long quand même
Et j'ai aussi utilisé ce genre de colonne... Aurevoir les gels et le BET!!! Vous m'avez fait perdre mon temps!!!
Le coup du gel est vraiment à n'utiliser que lorsque l'on obtient plusieurs fragments qui peuvent religuer et que l'on ne peut pas ciper. Et encore même là... Recemment je m'y suis risqué. Ca n'a rien donné et j'ai encore préféré screener mes clones plutôt que de persévérer dans cette voie du découpage de bandes. On m'a parlé (et en fait j'ai le protocole à mon bureau) d'une technique avec une bande de papier qui arrangerait bien des choses. J'ai pas essayé si vous voulez tenter je peux mettre le proto ici.
Personnellement j'essaie d'éliminer au maximum des possibilités de religuage parasite par PCR, restrictions et cipage, je purifie tout en nucléospin extract II. Depuis lors je ne mets jamais plus d'une semaine à avoir un clone.
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salut
Pourquoi pas ca peut etre interessant ton protocole piwi
Sinon les problemes liées à l'extraction des bandes des gels sont la conséquence d'un mauvais rendement d'extraction? J'utilise le kit de promega et personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais comme piwi j'essaye au possible de ne pas passer par la, a cause de la quantité d'ADN perdue.
Yoyo
Je vous avais parlé d'un protocole, le voici:
Faire migrer les fragments dans un gel sans BET en reproduisant deux fois le dépot.
Prendre la moitié du gel, le colorer au BET et le mettre en saran puis révéler aux UV afin de repérer les bandes. Juxtaposer le gel non coloré et trouer le gel sous le niveau de la bande et placer dans le trou une bande de papier DE 81.
Relancer la migration, les protéines vont venir se fixer sur le papier.
Récupérer le papier et le mettre dans un tube 0.5 ml percé puis le placer dans un tube 1.5 ml.
Imbibez le papier avec 100µl de TE NaCl 0.1M.
Centrifugez
Changez le tube 1.5 ml et imbibez le papier avec 100 µl TE NaCl 1M. Attendre un peu à TA puis centrifuger.
Purification phénol/chloroforme sur l'éluat.
Comme je vous le disais je n'ai jamais mis en oeuvre moi même ce protocole. Je vous le livre sans savoir ce qu'il donne. On m'a dit que ça marchait bien. Si vous tentez, pensez à laisser un message pour dire si effectivement c'est top.
Cordialement,
piwi
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