Bonjour,
Je travaille actuellement avec le plasmide pCDNA3 qui contient le gene de resitance a l'ampicilline. La sequence de ce gene est reverse complement dans la sequence du plasmide. Je souhaite remplacer ce gene par le celui de resistance a la kanamycine. Q: Dois-je inserer la sequence reverse complement ou ca n'a pas d'importance ?
Exup'
Salut,
Je ne comprends pas trop ta question... j'imagine que tu veux dire que la séquence codante est sur le brin inverse d'après la carte plasmidique de Invitrogen (lien).
La seule raison que je vois de placer ce gène dans cet orientation est d'éviter la transcription de l'autre gène placé après le promoteur CMV par "read-through"... De toute manière, lors de ton clonage, ce n'est pas plus difficile de rentrer ton insert en sens qu'en antisens!
De plus, il va falloir que tu t'assures de conserver le promoteur sur le plasmide (à moins d'insérer le tien), donc de bien insérer dans le bon sens.
Ouin, je ne suis pas trop clair, mais je n'ai pas encore pris mon café...
Et puis, j'avais une autre question : les deux antibio, la Kana- et la Néomycine, sont de la même famille (aminosides). Donc, est-ce que tu vas pas sélectionner les deux en ajoutant un seul antibio? Etant donné que l'Amp et la Néomycine sont là pour des choses différentes...
C'est une question que je pose, je ne me suis jamais retrouvée à bosser dessus
En ce qui concerne les CMV et SV40, je crois qu'ils ne seront exprimés dans les bactéries que si le promoteur est pA (info à vérifier). Tu en sais quelque chose, t1t0?
Cordialement,
En effet, le gène de résistance de Kana va entraîner la résistance à la Néo... bonne remarque! Comme j'ai précisé, je n'avais pas pris mon café!
Par contre, je ne crois pas qu'il y ait un promoteur eucaryote pour Neo dans pcDNA3. À vérifier!
Tito
Quel sacrilège, ne pas prendre son café avant de se mettre au pc!Envoyé par t1t0
En effet, le gène de résistance de Kana va entraîner la résistance à la Néo... bonne remarque! Comme j'ai précisé, je n'avais pas pris mon café!
Beh, le gène de résistance à la Néomycine sert à sélectionner les transfectants stables dans les cellules de Mammifères... Non?Par contre, je ne crois pas qu'il y ait un promoteur eucaryote pour Neo dans pcDNA3. À vérifier!
Tito
Le gène de résistance à l'Amp, lui, sert pour sélectionner les E. coli ayant intégré le vecteur.
Cordialement,
P.S. Au fait, je n'ai pas compris le pourquoi du changement du gène de résistance à l'Amp par celui de résistance à la Kana...
J'utilise actuellement ce vecteur pour vacciner des souris dans un modèle de leucémie. Le remplacement de l'Amp par la Kan est un pré-requis exigé par l'Afssaps pour que ce vaccin ADN puisse être considéré pour entrer en essai clinique chez l'Homme
Exup', crossing fingers...
Pourquoi alors ne pas prendre directement unplasmide avec le gène de résistance à la Kana?
Cordialement,
J'ai bien evidemment teste cette option, mais les resultats etaient moindres... il doit y avoir sur le plasmide des sequences qui stimulent de facon aspecifiques le systeme immunitaire. On veut donc les conserver comme "adjuvants"
