Purification des ARNm procaryote ?

[inviteea49608c]

bonjour a tous
voila je travaille sue la RT-PCR " amplification genique apres retro transcription"
je sais que pour faire ce genre d'application il faut extraire les ARN totaux puis en purifier les ARNm apres passage sur une colonne d'oligo-dt qui va accrocher les ARNm grace a leur queue poly-A puis amplifier notre sequence cible en utilisant des primer specifiques
c'est le cas pour les eucaryotes
ma question est comment peut on purifier les ARNm d'origine procaryote car ils sont depourvus d'une queue poly-A
-----

[invitee8b3f97e]

Salut !

Pour de la RT-PCR à partir d'ARNm procaryotes on ne purifie pas les ARNm. Une extraction des ARN totaux (kit avec colonne ou chloroforme isoamyl alcool par exemple) est suffisante.

[inviteea49608c]

bonjour excusez moi
mais comment peut on dans ce cas la reperer notre ARNm cible vu qu'il sera en quantité tres reduite par rapport au ARNm totaux
P.S je n'ai vraiment pas compris le processus
merci

[gorben]

Salut,

Il existe un kit chez ambion qui te permet de purifier les ARNm a partir des ARN totaux chez les bacteries. Ca marche plutot bien. Le principe c'est du pull down de tes ARN 16S - 23S via des sequences complementaires fixees sur des billes magnetiques.
Tu mixes le tout, tu enleves les billes et tu te retrouves avec de l'ARN 16S et 23S free (il te reste encore les 5S et ARNt mais c'est deja plus propre).

L'autre solution est de purifier tes ARN en utilisant la methode de "l'ARN boullli"... les ARNr sont instables a 95 degres a la difference des ARNm.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteea49608c]

merci pour votre aide

[inviteea49608c]

je veux savoir si vous me le permetez encore une fois
concernant la methode des ARN bouillis est ce qu'elle est valable pour eliminer les ARNt aussi bien que les ARNr

[invitee863e61a]

Salut,

Il existe un kit chez ambion qui te permet de purifier les ARNm a partir des ARN totaux chez les bacteries. Ca marche plutot bien. Le principe c'est du pull down de tes ARN 16S - 23S via des sequences complementaires fixees sur des billes magnetiques.
Tu mixes le tout, tu enleves les billes et tu te retrouves avec de l'ARN 16S et 23S free (il te reste encore les 5S et ARNt mais c'est deja plus propre).

L'autre solution est de purifier tes ARN en utilisant la methode de "l'ARN boullli"... les ARNr sont instables a 95 degres a la difference des ARNm.

A+

Cela m'intéresse, tu aurais un protocole à me donner en MP?

[gorben]

Salut,

Il est possible d'enlever les 5S et ARNt par un kit de la meme compagnie.

L'ARN bouilli c'est ca :

FEMS Microbiol Lett. 2003 Dec 5;229(1):97-101.

A simple and efficient Triton X-100 boiling and chloroform extraction method of RNA isolation from Gram-positive and Gram-negative bacteria.

Sung K, Khan SA, Nawaz MS, Khan AA.

US Food and Drug Administration, National Center for Toxicological Research,Division of Microbiology, 3900 NCTR Road, Jefferson, AR 72079, USA.

A fast, reliable, and inexpensive Triton X-100 boiling procedure for RNA isolation from both the Gram-positive and Gram-negative bacteria was developed. The yield of RNA was 0.2-2 mg per 10 ml bacterial culture. The method was tested on Gram-positive and Gram-negative bacteria of eight genera and nine species and yielded reproducible results. In parallel experiments, the Qiagen and hot phenol extraction methods both yielded RNA that contained contaminating 16S and 23S rRNA. The Triton X-100 boiling method reported here yielded RNA that was free
from 16S and 23S rRNA, contained full-length transcripts and did not require additional purification. The presence of specific mRNA in one of the RNA samples obtained by this procedure was demonstrated by partial amplification of a 732 bp vancomycin resistance gene, vanA, by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The presence of a full-length transcript (1031 bases) of the vanA gene was verified by Northern hybridization and probing with a digoxigenin (DIG)-labeled vanA PCR partial product. The method provides a rapid, reliable,
and simple tool for the isolation of good quality RNA suitable for various molecular biology experiments.

Je peux envoyer le papier en mp a ceux qui le veulent.

A+

[inviteea49608c]

bonjour est ce que vous pouvez me l'envoyer s'il vous plait cela m'interesse