Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

[invite17a570c1]

Bonjour,

Je crois que ma petite protéine est mal barrée chez coli, alors j'étas en train de voir pour d'autres systèmes d'expression

Bon, il s'agit d'une protéine humaine de 107 kDa que j'essaie d'avoir et purifier sous forme inactive monomérique et sous forme active mutlimérique (environ 800 kDa). Malgré mes Supercolis avec 30 000 plasmides dedans, j'ai un souci de production et je n'arrive pas trop à savoir d'où il vient... J'ai décidé de rester chez coli parce que les essais préliminaires d'expression de cette protéine mais avec un tag MBP (j'utilise hexa-His) ont été concluants.

Donc, je me posais deux questions :
* existe-t-il un moyen de savoir si une protéine forme des ponts S-S (programme bio-info, un test in vitro,...) ? Je me dis que l'on est parti pour une production cytoplasmique mais sans certitude que la protéine fasse des ponts S-S ce qui pourrait être l'origine de mon problème;
* j'ai vu que l'expression chez la levure n'est pas super avantageuse à cause de problèmes de repliements, donc j'ai décidé d'opter pour les baculovirus et les cellules de droso. Mais je ne sais pas ce qui est mieux : ça ou carrément des cellules de Mammifères (je suis dans un labo de microbio )... Et puis, est-ce que quelqu'un saurait me dire si le kit Invitrogen (pFastBac, je crois) est bien? Enfin, est-ce que quelqu'un a déjà fait des transfection avec baculovirus et peut m'éclaircir sur les points délicats...?


Merci beaucoup pour tout détail


Cordialement,
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[invited3f74a0a]

Bonjour,

Je suppose que tu as déjà pensé à ce que je vais te proposer, mais dans le doute...

• Si tu possède la structure, au format .pdb, de ta protéine il te suffit de calculer les distances entre chaque cystéines (à l'aide d'un script python par exemple), sachant que :

  La distance entre les 2 carbones à de 2 résidus cystéine impliqués dans un pont disulfure est de 4.2 Å (Czaplewski et al., 2004) à 7.5 Å

• In vitro, je suppose que tu as déjà pensé à tout ce qui est technique de base lorsque tu possède déjà un extrait de protéine, n'étant pas très au point sur ce domaine, je vais m'abstenir de dire des bêtises...

En espérant avoir été utile.

[invite17a570c1]

Salut,

En fait, j'essaie d'obtenir la protéine en question pour en établir la structure Et comme pour l'insant j'ai un petit souci de production, je n'ai pas d'extraits sur lesquels tester quoi que ce soit...

Merci pour les idées, en tout cas. Il est vrai qu'elles me serviront le moment venu


Cordialement,

[invited3f74a0a]

Re-Bonjour,

C'est bien ce que je pensais... Je ne peux donc vraiment pas t'aider ! Je peux juste te souhaiter bonne chance...

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

existe-t-il un moyen de savoir si une protéine forme des ponts S-S (programme bio-info, un test in vitro,...) ? Je me dis que l'on est parti pour une production cytoplasmique mais sans certitude que la protéine fasse des ponts S-S ce qui pourrait être l'origine de mon problème;

J'imagine que tu fais une coloration de gel à l'argent pour voir ta protéine. Parfois on ne voit pas la bande. Ca ne veut pas dire que la protéine n'est pas exprimée. Comme ta protéine est tagguée tu peux faire un westernblot en dénaturant les protéines au bête beta mercaptoethanol. Normalement cela rompt les ponts
Tu peux faire des gels en urée si tu ne souhaites pas virer les ponts.

pour les transfections j'ai pas utilisé de bacculo. Mais ca doit se faire proprement non avec un réactif de transfection classique (jet pei , lipofectamine ect...?)

piwi

[invite17a570c1]

Merci quand même, Goldfish

J'ai eu quelques soucis avec mes tout premiers échantillons. Je ne fais que des gels en bleu de Coomassie en attendant les anticorps pour un Western.
En fait, je posais la question pour les ponts S-S parce que j'avais pensé que le fait de la produire dans le cytoplasme bactérien faisait que les ponts S-S ne se formeraient pas (s'il y en a) et donc, ça pouvait être à l'origine de mon souci de production.
Du coup, au lieu de m'*mm*rd*r à faire une nouvelle construction avec OmpA ou un autre peptide signal, j'ai décidé de passer en baculovirus directement. Mais moi n'avoir jamais fait ça, alors moi ne pas savoir si c'est une idée facilement réalisable pour un microbiologiste
Piwi, tu as fait tes expressions en quoi? Cellule de Mammifères, je suppose?


Cordialement,

[piwi]

Oui ce sont des cellules de mammifères transformées avec un retrovirus. Le retrovirus étant lui même produit à partir de cellules un peu spéciales (je n'entre pas dans le détail) elles mêmes transformées avec un vecteur retroviral modifié.
Ok c'est clair que le bricolage fait froid dans le dos dit comme ça. Mais ca n'est pas si compliqué que ça en fait ()

Sinon moi y en a pas être microbiologiste mais il n'y a jamais de protéines avec des ponts disuflures dans les bactéries? Elles ne produisent pas les enzymes? J'ai un peu du mal à croire cela.
Un possiblité en revanche est que tes protéines soient toxiques pour tes bactéries. Du coup seules celles qui expriment faiblement la produisent, les autres meurent. Dans ce cas le rendement est moisi. Une autre possibilité est que tes bactéries rejetent ta protéine dans des corps d'inclusions. Pense à bien soniquer tes extraits si tu ne le fais pas déjà sinon tu ne trouveras jamais ton graal. Il y a encore une possibilité qui est vraiment une plaie quand ça arrive, c'est que ta protéine soit inssoluble dans le cytoplasme des bactos (problème de modifications post traductionnelles). Du coup elle précipite dans tes extraits et tu la perds. Là faut passer au levures, t'as pas vraiment le choix.

Cordialement,
piwi

[piwi]

Encore une chose.
Pour étudier sur gel ta production oublie le bleu de coomassie. C'est pas terrible.
Le bleu colloidal est meilleur. Le plus sensible (et le plus chiant faut le reconnaitre) reste la coloration à l'argent.

[invite17a570c1]

Merci pour tes remarques et suggestions, Piwi.

Oui ce sont des cellules de mammifères transformées avec un retrovirus. Le retrovirus étant lui même produit à partir de cellules un peu spéciales (je n'entre pas dans le détail) elles mêmes transformées avec un vecteur retroviral modifié.
Ok c'est clair que le bricolage fait froid dans le dos dit comme ça. Mais ca n'est pas si compliqué que ça en fait

Ca t'arrive parfois de faire des trucs simples?

Sinon moi y en a pas être microbiologiste mais il n'y a jamais de protéines avec des ponts disuflures dans les bactéries? Elles ne produisent pas les enzymes? J'ai un peu du mal à croire cela.

Toi commencer à parler comme moi, pas bien, marque toi perdre neurones Bon, sérieusement : E. coli fait des ponts disulfure, mais au niveau du périplasme. Donc, quand tu fais produire des protéines avec des ponts S-S chez coli, tu ajoutes en général un peptide signal (OmpA le plus souvent ou béta-lactamase) pour adresser la protéine. L'environnement périplasmique étant oxydant, ça permet la formation des ponts.

Un possiblité en revanche est que tes protéines soient toxiques pour tes bactéries. Du coup seules celles qui expriment faiblement la produisent, les autres meurent. Dans ce cas le rendement est moisi.

Oui, absolument. C'est pour ça que j'ai fait 2 conditions de cultures : à 20°C et à 16°C (en plus des 3 antibios et du glucose en raison du promoteur lacUV5 de la T7-polymérase). Celles à 20°C n'étaient pas très heureuses (donc, protéine assez toxique apparamment, malgré toutes les contraintes), celles à 16°C ont atteint une DO (600nm) = 12 en 36 h (!), alors j'ai décidé de tester 13°C (en parallèle de 16°C). Je ne peux pas descendre plus bas à cause de mon plasmide pGROS (il est pô gros, juste dodu ) qui assure la surproduction de GroES et GroEL; mais le souci est que ces deux-là deviennent presque inactives en-dessous de 12-13°C...

Une autre possibilité est que tes bactéries rejetent ta protéine dans des corps d'inclusions. Pense à bien soniquer tes extraits si tu ne le fais pas déjà sinon tu ne trouveras jamais ton graal.

Je fais 4 cycles de sonication à 23% de puissance, 20 sec et après chaque cycle je refroidis pendant 1 min dans un mélange eau-glace. C'est vraiment chiant, la sonication...

Il y a encore une possibilité qui est vraiment une plaie quand ça arrive, c'est que ta protéine soit inssoluble dans le cytoplasme des bactos (problème de modifications post traductionnelles). Du coup elle précipite dans tes extraits et tu la perds. Là faut passer au levures, t'as pas vraiment le choix.

Cordialement,
piwi

On y a pensé aussi, du coup je resuspends mes culots bactériens avant sonication dans un tampon à 0,4M de KI. Je vais éviter d'être stupide la prochaine fois (dans 2 jours ) et ne pas virer les culots de bactos soniquées, mais les resuspendre et chercher si de la protéine il y a... Au pire, il paraît que le tampon à KSCN est 'achement bien pour éviter les précipitats

Quoi qu'il en soit, je vais lire les manuels d'utilisation ce soir et commander un kit baculo demain... J'en ai trouvé d'autres qui produisent de la protéine en 6h, en free-cell, mais la quantité est largement insuffisante pour ce que je veux faire, du coup, l'intérêt que la produise dans un tel système est limité


Ceci dit, si quelqu'un a de l'expérience avec les baculos, je suis toujours à la demande . Merci!


Cordialement,

[invite17a570c1]

Au fait, un truc marrant : dans deux cas, il me semble voir une espèce de bande dans le stacking qui est toujours dans le puits correspondant à l'extrait soluble du même type de construction...
Ca pourrait signifier quelque chose?


Cordialement,

[Zellus]

Salut,

existe-t-il un moyen de savoir si une protéine forme des ponts S-S (programme bio-info, un test in vitro,...) ?

La seule technique que je connaisse c'est l'électrophorèse en diagonale.

J'ai décidé de rester chez coli parce que les essais préliminaires d'expression de cette protéine mais avec un tag MBP (j'utilise hexa-His) ont été concluants.

Pourquoi ne pas avoir gardé la MBP comme étiquette alors ?

C'est pour ça que j'ai fait 2 conditions de cultures : à 20°C et à 16°C

Tu as essayé à 25°C, 28°C ou même 37°C ?

celles à 16°C ont atteint une DO (600nm) = 12 en 36 h

Mais c'est énorme cette DO !!!

Cordialement,
Zellus

[piwi]

Je pense que ce n'était pas 12 qu'il fallait lire mais 1.2.
Sinon c'est vrai que moins de 20°C n'est pas beaucoup, mais j'imagine que si Malicia en est là c'est qu'elle a essayé les températures plus conventionnelles (37°C et 30°C)

[invite17a570c1]

Hello,

La seule technique que je connaisse c'est l'électrophorèse en diagonale.

Ah tiens, connais pas moi Je vais me renseigner. Y a-t-il un papier méthodologique qui la présente?

Pourquoi ne pas avoir gardé la MBP comme étiquette alors ?

Parce qu'il me faut la forme active aussi. Or, la MBP provoque un encombrement stérique trop important et ça gêne la formation du multimère (ça l'en empêche, en fait)... Du coup, je ne vais pas m'amuser à faire 30 000 tags pour la même chose

Tu as essayé à 25°C, 28°C ou même 37°C ?

Oui... A partir de 22°C, les bactos crèvent carrément J'en ai marre de porter leur deuil. Non, sans plaisanter, la protéine est trop toxique pour elles et donc, je suis obligée de descendre la température à mort. Je verrai dans deux jours ce que ça donne à 13°C.

Mais c'est énorme cette DO !!!

Je pense que ce n'était pas 12 qu'il fallait lire mais 1.2.

Euh... non, non, c'est bien 12 (pour une des cultures, j'en avais même 14...). J'ai pris la DO 5 fois pour être sûre parce que ça me paraissait fort aussi. En fait, ce qui m'a gêné dans cette histoire c'est que les bactos donnent cette DO au bout 36h, avec 3 antibios et à 16°C, pas la valeur de la DO en elle-même... Je verrais demain soir si c'est reproductible, de toute manière. Et dans les deux conditions d'induction que je fais cette fois (milieu ZYP et induction par l'IPTG).


Cordialement,

[inviteec077029]

Salut,

essaye de faire une production cytoplasmique chez E.Coli favorisant les corps d'inclusion, solubilise tes corps d'inclusion avec dénaturant style Urée 8M et réduit les éventuels ponts ss mal formés avec du Bmercapto. Purifie t'as prot surtout que c'est bcp plus simple sous formes dénaturés alors que souvent dans le périplasme c'est la galére pour la purifie. Fait un WB pour vérifier si t'as prot est présente avec un AC anti-his
Procéde ensuite à une renaturation!!

[invite17a570c1]

Merci, Bacillus, mais... non

Je fais déjà une production cytoplasmique chez coli. Si je mets du KI c'est justement pour éviter au maximum les corps d'inclusion. Outre la structure, il me faut la protéine en forme pour les études fonctionnelles Donc, si je dois choisir entre jongler avec un tas de solutions chimiques qui l'agressent et jongler en bio mol pour la faire produire dans des cellules plus adaptées, je préfère la seconde solution.
Je posais la question sur les ponts disulfure uniquement pour savoir si je peux apprendre avant d'avoir les extraits si la protéine est susceptible de former ces ponts, ce qui pourrait être une raison à mon problème de la semaine dernière...

Sinon, pour la purif à partir du périplasme je serais plutôt bien conseillée par l'équipe voisine : ils étudient uniquement des protéines périplasmiques


Cordialement,

[invitec0b62935]

Je posais la question sur les ponts disulfure uniquement pour savoir si je peux apprendre avant d'avoir les extraits si la protéine est susceptible de former ces ponts, ce qui pourrait être une raison à mon problème de la semaine dernière...

Si ta protéine est d'origine humaine : les cystéines forment des ponts disulfures si la protéine est secrétée, si ou si elle est dans la lumière du RE, du Golgi, dans les mitochondries, endosomes, peroxysomes etc... Les cystéines ne sont pas appariées dans le cytosol ou dans le noyau.

107 kDa, c'est très gros pour une expression en bactérie. Parfois ça marche mais en général ça finit en corps d'inclusion ou en protéine non exprimée. Le passage en baculovirus me semble inévitable dans ton cas.

[invitec0b62935]

Au fait, un truc marrant : dans deux cas, il me semble voir une espèce de bande dans le stacking qui est toujours dans le puits correspondant à l'extrait soluble du même type de construction...
Ca pourrait signifier quelque chose?

Ca pourrait effectivement signifier que tu as un splendide corps d'inclusion !

[invitec0b62935]

Au fait, un truc marrant : dans deux cas, il me semble voir une espèce de bande dans le stacking qui est toujours dans le puits correspondant à l'extrait soluble du même type de construction...
Ca pourrait signifier quelque chose?

Tu utilises du DTT pour lyser tes bactéries ? Si ce n'est pas le cas, il est possible que ta protéine forme des ponts disulfures aberrants lors de la lyse des bactéries.

[invite17a570c1]

Tu utilises du DTT pour lyser tes bactéries ? Si ce n'est pas le cas, il est possible que ta protéine forme des ponts disulfures aberrants lors de la lyse des bactéries.

Je resuspends dans un tampon 50mM Tris-HCl pH 7,7 + 10% sucrose (il paraît que ça stabilise la protéine, je ne sais pas comment) + 0,4M de KI. Je casse les cellules en sonication, mais je pensais à passer à la french press, il paraît que c'est mieux...
Le DTT est ajouté dans le Laemmli avant le dépôt.

Tu penses qu'elle formerait des ponts S-S bizarres quand même?


Cordialement,

[Zellus]

Salut,

Pour la technique dont je t'ai parlée, je l'ai découverte dans le Garrett et Grisham . Sinon j'ai trouvé ça aujourd'hui qui pourrait t'intéresser je pense.

Sinon nous au labo on met 1mM de mercapto-éthanol ou de DTT dans nos tampons pour éviter un minimum l'oxydation des protéines.

12 de DO c'est bien ce qu'il me semblait, parce que 1,2 au bout de 36h quand même ... Et tu induis avec l'IPTG à cette DO ? Mais je ne comprends pas pourquoi tu veux atteindre des DO aussi élevées ... Pour avoir plus de bactéries qui expriment ta protéine ? Est-ce que ça ne contribue pas plutôt à les faire crever plus vite ?
Moi j'induis à 0,7 de DO à peu près mais je suppose que tu as déjà essayé dans ces conditions. Ca doit pas être suffisant sans doute pour une protéine aussi grosse ...

Et pour tes oligomères tu peux pas attendre de purifier du monomère et ensuite trouver des conditions favorables pour les former in vitro ?

Cordialement,
Zellus

[invite17a570c1]

Hello,

Salut,

Pour la technique dont je t'ai parlée, je l'ai découverte dans le Garrett et Grisham . Sinon j'ai trouvé ça aujourd'hui qui pourrait t'intéresser je pense.

Oki doki, merci

12 de DO c'est bien ce qu'il me semblait, parce que 1,2 au bout de 36h quand même ... Et tu induis avec l'IPTG à cette DO ? Mais je ne comprends pas pourquoi tu veux atteindre des DO aussi élevées ... Pour avoir plus de bactéries qui expriment ta protéine ? Est-ce que ça ne contribue pas plutôt à les faire crever plus vite ?

Non, ce sont les DO que j'obtiens en 36h en milieu ZYP (auto-inducteur). Quand je fais avec du LB, j'iduis à DO environ 2 (50uM d'IPTG final) et je les arrête à environ 4-5 de DO (de toute manière, elle ne monte pas plus haut dans ces conditions). Le truc est que même dans ces conditions, je détecte la protéine en blot mais je ne la vois pas du tout en bleu de Coomassie... Ce qui signifie qu'il y a beaucoup de dégradation ou peu de production (je n'ai presque pas de corps d'inclusion, j'avais traité les différents culots issus des extraits bruts) mais que la protéine est soluble
Quoi qu'il en soit, passage en baculo obligatoire

Et pour tes oligomères tu peux pas attendre de purifier du monomère et ensuite trouver des conditions favorables pour les former in vitro ?

Le hic est que là j'essayais d'avoir le monomère... Je vais tester une culture à 13-14°C avec une chaperonne spéciale "antarctique" histoire d'être sûre que je ne peux vraiment rien faire de plus en coli et ... vive les mouches!


Cordialement,