Infos protocole

[invitebabb0bd6]

Bonjour a tous
Je souhaite avoir des infos sur les conditions d'immunoprecipitations à partir de culture organotypique (explants tissulaire cerveau en particulier)??
Merci
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[invite8c0cc995]

Voilà quelques pistes à explorer :
- les conditions d'IP dépendent de la protéine à immunoprécipiter : sa localisation (membranaire, cytosolique, nucléaire) conditionne le type d'extraction protéique à effectuer, de son abondance va dépendre la quantité de lysat à utiliser .
- A prendre aussi en compte, le type d'anticorps (monoclonal, polyclonal, lapin, souris ?), qui va dicter le type de billes à utiliser.

Cordialement,

[invitebabb0bd6]

la proteine est la nitric oxide synthase phosphorylée elle doit etre memnbranaire et peut etre cytosolique je l' extrai d'une tranche de cerveau de 250micrometre elle est donc en tres petite quantitée
tp d'extraction pour un tissu (tranche de cerveau ) est il différent qu'à partir de culture?

[invite8c0cc995]

Des cellules en culture sont très facilement lysable par rapport à des tissus, qui peuvent être fibreux, ou tres riche en graisse (comme le cerveau). concernant la quantité de tissu, de combien de mg disposes tu ? Pour des morceaux de tissus plus important (quelques 100aines de mg), on procède en général d'abord à une homogénéisation "physique" pour casser le tissu, et permettre une action homogène du tampon de lyse sur tout le tissu. Si ta protéine est membranaire, il faudra vraissemblablement utiliser des tampons de lyse avec une forte quantité de détergent.
As tu essayé de mettre en évidence la NOS dans des coupes de cerveau par immunofluorescence ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitebabb0bd6]

Des cellules en culture sont très facilement lysable par rapport à des tissus, qui peuvent être fibreux, ou tres riche en graisse (comme le cerveau). concernant la quantité de tissu, de combien de mg disposes tu ? Pour des morceaux de tissus plus important (quelques 100aines de mg), on procède en général d'abord à une homogénéisation "physique" pour casser le tissu, et permettre une action homogène du tampon de lyse sur tout le tissu. Si ta protéine est membranaire, il faudra vraissemblablement utiliser des tampons de lyse avec une forte quantité de détergent.
As tu essayé de mettre en évidence la NOS dans des coupes de cerveau par immunofluorescence ?

Non pas encore