Knock-down

[invite10adf645]

Bonjour,

je souhaite lance une manip de knock-down chez le rat pour valider un résultat obtenu sur la souris KO.
J'hésite entre anti-sens et RNAi, mais les séquences d'antisens pour mon gène d'intérêt ont déjà été publiées. Donc je pencherai plutôt pour cette solution.
Par contre la séquence est une séquence ADN (ACGT), ce qui m'a beaucoup surpris car je croyais qu'on dirigait une séquence d'ARN (ACGU) contre son complémentaire.

Ca vous choque aussi ou c'est moi qui n'ai pas compris un truc ?

Merci !!
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[invitea0443c8c]

Bonjour!
Je ne comprends pas bien.... Tu veux faire un KO chez le rat avec une stratégie anti sens ou RNAi??? Selon moi un véritable KO se fait par interuption du gène à partir de cellules ES. Si tu fais du RNAi ou de l'anti sens ce ne sera pas du stable donc tu travailleras en lignées cellulaires (ou culture primaire) et pas en animal (sauf chez C.elegans ou là tu peux faire du RNAi sur animal entier en donnant aux vers des bactéries transformées avec le plasmide permettant le silencing).
Et pour ce qui est de l'anti-sens c'est un petit peu moins efficace que les siRNA. Tu peux acheter des siRNA spécifiques de ton gène même si ces séquences ne sont pas publiées. Par exemple chez QIAGEN tu as quasiment toujours 4 siRNA différents par gène, et pour les gènes très étudiées tu peux même avoir un siRNA validé.

Ce n'est pas un problème que la séquence soit en ADN même si effectivement la séquence effectrice sera en ARN.

Ou alors je n'ai rien capté au problème^^

V.

[invite10adf645]

En fait chez le KO on a parfois des phénomènes compensatoires via la régulation d'autres gènes. Donc pour éliminer ce biais il faudrait que je fasse des tests complémentaires chez le rat après knock-down du gène d'intérêt.
De plus je fais des tests comportementaux, et ces tests sont plus reproductibles chez le rat.

Donc à ce niveau j'ai le choix entre siRNA ou antisens, et je préfèrerai utiliser des antisens pour deux raisons :
1) la séquence est déjà publiée et validée. Même si les sites comme Sigma, Qiagen etc... proposent toujours des siRNA à la pelle, ils ont été généré automatiquement par un ordinateur, et jamais testés.
2) je veux cibler spécifiquement les ganglions rachidiens et il a été montré que les antisens injectés en intrathécal se dirigeaient naturellement vers ces ganglions.

Par contre je pensait qu'il fallait générer un brin ARN complémentaire de la cible, et pas un brin ADN. C'est à ce niveau que j'ai du mal à comprendre...

Si quelqu'un a déjà fait ce genre de manips, même sur des cellules, je serai super content d'avoir des infos

[invitea0443c8c]

En fait chez le KO on a parfois des phénomènes compensatoires via la régulation d'autres gènes. Donc pour éliminer ce biais il faudrait que je fasse des tests complémentaires chez le rat après knock-down du gène d'intérêt.
De plus je fais des tests comportementaux, et ces tests sont plus reproductibles chez le rat.

Je ne comprends toujours pas comment tu vas faire une transfection transitoire ARN antisens ou siRNA sur un rat entier^^.
L'appellation KO est utilisée sur les cellules ES pour générer des animaux KO, ou alors peut-être utilises tu cette expression en tant qu'abus de langage?

Donc à ce niveau j'ai le choix entre siRNA ou antisens, et je préfèrerai utiliser des antisens pour deux raisons :
1) la séquence est déjà publiée et validée. Même si les sites comme Sigma, Qiagen etc... proposent toujours des siRNA à la pelle, ils ont été généré automatiquement par un ordinateur, et jamais testés.
2) je veux cibler spécifiquement les ganglions rachidiens et il a été montré que les antisens injectés en intrathécal se dirigeaient naturellement vers ces ganglions.

Sauf que sur les 4 proposés c'est très rare qu'il n'y en ait pas au moins un qui fonctionne. Mais évidemment si c'est publié avec antisens et que ca down régule ce que tu veux et où tu veux, c'est ce qu'il faut faire...

V.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite10adf645]

Je ne compte pas faire du silencing sur le rat entier ! Juste au niveau de certains ganglions que je cible par une injection localisée.

Pour être clair, dans mon cas : le KO c'est chez la souris et c'est total, les antisens c'est chez le rat et c'est local (et temporaire).

Je n'ai pas de problème au niveau du design de la manip, mais je cherche juste à comprendre pourquoi on n'utilise pas des RNA antisens, mais des DNA qui vont former des hétéroduplexes in vivo...
Donc même une explication au niveau cellulaire me conviendrai.

[invitea0443c8c]

Je ne compte pas faire du silencing sur le rat entier ! Juste au niveau de certains ganglions que je cible par une injection localisée.

Pour être clair, dans mon cas : le KO c'est chez la souris et c'est total, les antisens c'est chez le rat et c'est local (et temporaire).

Tout à fait et c'est pour cela que je ne comprenais pas que tu utilises l'expression "KO" pour une approche siRNA ou anti sens... Mais c'est purement sémantique je te l'accorde. Et les anti-sens ne sont pas utilisées que chez le rat mais en lignées ce qui fait que je ne comprenais pas ta quetsion initiale, j'ai simplement voulu savoir exactement de quoi tu parlais.

Je n'ai pas de problème au niveau du design de la manip, mais je cherche juste à comprendre pourquoi on n'utilise pas des RNA antisens, mais des DNA qui vont former des hétéroduplexes in vivo...
Donc même une explication au niveau cellulaire me conviendrai.

Certainement parce que la longueur de la séquence permet l'hybridation en hétéroduplex, contrairement aux siRNA.

V.

[invite76fd82a1]

Bonjour,

je souhaiterais comprendre comment se déroule le knock-down par ARN interférence (anti-sens).
Dites moi si c'est de cette façon qu'est réalisée la manipulation : on réalise un transgène avec la séquence anti-sens de l'ARNm à mettre sous silence puis on injecte le transgène dans la souris ( où et par quelle méthode ? Microinjection ?). Les ARNm produits par la copie originelle du gène et par la copie introduite sont complémentaire. Les ARNm s'hybrident et forment une molécule d'ARN double brin. L'ARN double-brin formé est reconnu par le complexe DICER qui le dégrade en petits fragments les siRNAs. Les siRNAs sont recrutés par des nucléases. Les nucléases vont dégrader les ARNm qui ont une séquence complémentaire aux siRNAs. il y a donc dégradation de l'ARNm et donc pas de protéine. Est-ce exact ?

Par ailleurs, dès lors qu'on fait un knock-down, un contrôle doit être réalisé. Je pensais à un dsGFP qui ne s'hybriderait à aucun ARNm chez la souris ou est ce qu'il faut faire autre chose comme contrôle, comment et pourquoi ? Expliquez moi.

Je vous remercie pour votre réponse