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Purification Protéines Tag 6His



  1. #1
    Mahatmah

    Purification Protéines Tag 6His

    Bonjour,

    J'aurais aimé quelques suggestions concernant la purification de protéines en Tag 6-His.

    A partir de bactéries BL21 induites, je produit une protéine tagguée 6His de 40 kDa.

    Nous utilisons le système de purification Ni-NTA, et je suis confronté à deux ennuis.
    A savoir, les manips sont répétables et le protocole de purif semble globalement au point.

    1) Les protéines se fixent mal aux billes de nickel donnant un rendement très faible, je retrouve la majorité de la protéine dans le surnageant, malgré 4 heures d'incubation. Il est possible qu'elles aient perdu leur Tag, je vais vérifier avec un anticorps cet après midi, mais si tel est le cas à quoi cela peut-il être du ?

    2) J'ai fait un suivi de la protéine en prenant des aliquots à chaque étape de purif. Je retrouve ma protéine dans le surnageant, des traces minimes dans les lavages et elle est à la bonne taille. En revanche la fraction purifiée (éluat) donne une bande légèrement en dessous des autres ... la protéine a pu subir une dégradation, mais pourquoi juste au moment de l'élution ? Peut être aussi que seule cette protéine dégradée se fixe aux billes mais pour quelles raisons ?

    NB : Les suivis sont effectués en WB donc spécifiques.

    Merci d'avance !

    -----


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  3. #2
    piwi

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    1) Les protéines se fixent mal aux billes de nickel donnant un rendement très faible, je retrouve la majorité de la protéine dans le surnageant, malgré 4 heures d'incubation. Il est possible qu'elles aient perdu leur Tag, je vais vérifier avec un anticorps cet après midi, mais si tel est le cas à quoi cela peut-il être du ?

    2) J'ai fait un suivi de la protéine en prenant des aliquots à chaque étape de purif. Je retrouve ma protéine dans le surnageant, des traces minimes dans les lavages et elle est à la bonne taille. En revanche la fraction purifiée (éluat) donne une bande légèrement en dessous des autres ... la protéine a pu subir une dégradation, mais pourquoi juste au moment de l'élution ? Peut être aussi que seule cette protéine dégradée se fixe aux billes mais pour quelles raisons ?
    Bonjour,

    Ce qui arrive parfois avec le [His]6 c'est qu'il se replie sur la protéine, du coup le rendement de fixation est moisi. Une petite dégradation de la protéine pourrait empêcher cela et augmenter l'affinité de cette version pour les billes. Ce phénomène est totalement protéine dépendant. Difficile de vous dire quoi faire à priori pour augmenter votre fixation.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  4. #3
    Vinc

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Bonjour!
    Première remarque, le 6His peut être utilisé avec des billes nickel ou des billes cobalt et il semble que le cobalt soit un peu plus spécifique mais le nickel est tout de même sensé permettre d'obtenir de bons résultats.

    Citation Envoyé par Mahatmah Voir le message
    1) Les protéines se fixent mal aux billes de nickel donnant un rendement très faible, je retrouve la majorité de la protéine dans le surnageant, malgré 4 heures d'incubation. Il est possible qu'elles aient perdu leur Tag, je vais vérifier avec un anticorps cet après midi, mais si tel est le cas à quoi cela peut-il être du ?
    Il est possible que ce faible rendement soit du au collage non spécifique sur les billes et dans ce cas, une solution peut-être de saturer les billes en faisant un préclear (PBS BSA3%) avant d'ajouter le lysat à purifier.


    Citation Envoyé par Mahatmah Voir le message
    2) J'ai fait un suivi de la protéine en prenant des aliquots à chaque étape de purif. Je retrouve ma protéine dans le surnageant, des traces minimes dans les lavages et elle est à la bonne taille. En revanche la fraction purifiée (éluat) donne une bande légèrement en dessous des autres ... la protéine a pu subir une dégradation, mais pourquoi juste au moment de l'élution ? Peut être aussi que seule cette protéine dégradée se fixe aux billes mais pour quelles raisons ?
    Lorsque tu parles de différence de taille, est-ce reproductible et si oui de combien est cette différence? Quels sont les tampons utilisés (pour toutes les bandes)?


    Citation Envoyé par Piwi
    Ce qui arrive parfois avec le [His]6 c'est qu'il se replie sur la protéine, du coup le rendement de fixation est moisi.
    Moui mais a priori pour une purification His tag on est en guanidium ou en urée donc en conditions dénaturantes...

    V.
    Primum non nocere.

  5. #4
    Mahatmah

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Merci de vos remarques ... pour répondre à Vinc :

    - J'utilise déjà de l'imidazole pour empêcher les collages non spécifiques. Je fais aussi une ultracentrifugation avant la purif pour enlever tous les résidus, à mon avis, une ligation non spécifique diminuerait mon rendement sans le sapper à ce point. Je retiens la suggestion au cas ou.

    - Les résultats ont été reproduits pour la différence de taille ... celle-ci est de 5 -10 kDa pour une proteine de 40kDa.
    Le tampon utilisé est un NaH2PO4 + NaCl avec diverses concentrations d'Imidazole, et je l'utilise dès là sonication des bactéries. le tampon est le même pour chaque bande.

    - Ni urée ni rien de tout ça ! Pour les besoins de l'entreprise je travaille en conditions natives (j'aurais du le préciser !). Ce sont des tampons non dénaturants, aussi la théorie de piwi me parait très probable ... c'est malheureusement l'hypothèse à laquelle j'étais arrivé moi aussi, et si c'est le cas, c'est la tuile .

    Merci pour vos conseils en tout cas.

  6. #5
    piwi

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    J'ai deux protocoles de purif en histag et pas d'urée ou de guanidine chez moi.
    Ce que j'ai avancé vient d'une remarque qu'avait fait un spécialiste de la purif dans un séminaire technique. Il faisait d'ailleurs remarquer que la purif en histag était la moins bonne de toute au niveau de la spécificité et du rendement.

    Personnellement je travaille actuellement en GST, les résultats préliminaires sont bons, je vais voir sur la grosse manip' (in process).
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Mahatmah

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    J'avais pensé à utiliser GST ... seulement mon job consiste à purifier pour faire des tests d'interactions protéiques.

    J'ai donc l'impératif d'avoir une protéine native avec des sites disponibles pour interactions. Le tag GST est très gros et a une facheuse tendance à bloquer les interactions ... damned.

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  10. #7
    piwi

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Il existe la serie de plasmides pGEX-4T qui possède un site de clivage par la thrombine. On peut ainsi libérer la protéine de la GST et n'éluer que la protéine d'intérêt.
    Cela ne pourrait il pas être une solution pour vous?
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  11. #8
    Mahatmah

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Oui ce sera en effet la solution de dernier recours ... car cela nous ferait reprendre le travail depuis le début.

    Mais je crois bien qu'on va devoir en arriver là.

  12. #9
    Zellus

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Salut,

    Citation Envoyé par Mahatmah
    A savoir, les manips sont répétables et le protocole de purif semble globalement au point.
    Qu'est-ce que tu veux dire par là, vu que apparemment il y a encore des choses à mettre au point ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    1) Les protéines se fixent mal aux billes de nickel donnant un rendement très faible, je retrouve la majorité de la protéine dans le surnageant, malgré 4 heures d'incubation. Il est possible qu'elles aient perdu leur Tag, je vais vérifier avec un anticorps cet après midi, mais si tel est le cas à quoi cela peut-il être du ?
    Je ne sais pas exactement ce que tu as fait donc j'ai quelques questions :
    • Tu fais ta purif en batch (c'est à dire pas sur colonne), c'est bien ça ?
    • Es-tu sûr de mettre assez de résine pour fixer toute ta protéine ?
    • Je suppose que tu mets des inhibiteurs de protéases quand tu lyses tes cellules ? Et y aurait pas d'EDTA, d'EGTA ou tout autre chélateur de nickel qui empêcherait la fixation de ta prot ?
    • Tu dis mettre de l'imidazole lors de la fixation de ta prot. Tu en mets combien exactement ?

    Sinon le problème en batch, contrairement aux purifs sur colonne, c'est que les autres protéines qui ne se fixent pas sur la résine restent en permanence en contact avec ta prot, ce qui augmente les risques de protéolyse. Et 4 heures, je trouve ça très long quand même ...

    Citation Envoyé par Mahatmah
    2) J'ai fait un suivi de la protéine en prenant des aliquots à chaque étape de purif. Je retrouve ma protéine dans le surnageant, des traces minimes dans les lavages et elle est à la bonne taille. En revanche la fraction purifiée (éluat) donne une bande légèrement en dessous des autres ... la protéine a pu subir une dégradation, mais pourquoi juste au moment de l'élution ? Peut être aussi que seule cette protéine dégradée se fixe aux billes mais pour quelles raisons ?
    Combien de temps dure ta purif au total, et chacune de tes étapes ? La protéine restée sur la résine aura passé plus de temps que celle non fixée dans le support où tu fais ta manip, donc là encore, elle a plus de chance d'être dégradée. Surtout si parmi les autres protéines également fixées (est-ce qu'il y en a d'autres d'ailleurs ?) il y a des protéases (qui en se fixant deviennent plus concentrées que dans ton lysat ...)

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Les suivis sont effectués en WB donc spécifiques
    Donc c'est un anticorps anti-ta protéine c'est bien ça ? Tu n'aurais pas un anticorps anti-6His à ton labo pour vérifier si c'est l'étiquette ou une partie de ta prot qui est dégradé ?

    Citation Envoyé par piwi
    Ce qui arrive parfois avec le [His]6 c'est qu'il se replie sur la protéine, du coup le rendement de fixation est moisi. Une petite dégradation de la protéine pourrait empêcher cela et augmenter l'affinité de cette version pour les billes.
    C'est une possibilité en effet, même si ce n'est pas la plus fréquente.

    Citation Envoyé par Vinc
    Première remarque, le 6His peut être utilisé avec des billes nickel ou des billes cobalt et il semble que le cobalt soit un peu plus spécifique mais le nickel est tout de même sensé permettre d'obtenir de bons résultats.
    En effet, les histidines fixent moins bien le cobalt que le nickel, et donc seules les protéines qui ont beaucoup d'histidines (comme une prot avec un 6His ) se fixeront. L'utilisation du cobalt augmente donc bien la spécificité.

    Citation Envoyé par Vinc
    Moui mais a priori pour une purification His tag on est en guanidium ou en urée donc en conditions dénaturantes...
    Ah bon ? Je suis étonné moi aussi. Je fais des purifs sans tout ça et ça marche très bien.

    Citation Envoyé par piwi
    Il faisait d'ailleurs remarquer que la purif en histag était la moins bonne de toute au niveau de la spécificité et du rendement.
    Oui, parce que y a plein de prot qui ont des histidines dans leur séquence (et donc qui piquent de la place à la prot à purifier sur la résine), alors que c'est plus rare de tomber sur une protéine qui a un site de fixation du glutathion par exemple.

    Autres questions qui me viennent Mahatmah (avant de filer che moi ) :
    • Tu aurais les photos de tes gels et de tes WB ?
    • Tu utilises quelles quantités d'imidazole à tes différentes étapes ?

    Bon j'y go. Je répondrai pas avant environ 1 heure si besoin.
    Salut !

  13. #10
    Mahatmah

    Thumbs down Re : Purification Protéines Tag 6His

    Bonjour !

    Alors en réponse aux questions.

    A savoir, les manips sont répétables et le protocole de purif semble globalement au point.

    Qu'est-ce que tu veux dire par là, vu que apparemment il y a encore des choses à mettre au point ?
    Mes résultats sont répétés après différentes purifs, sous différentes conditions.
    Mon protocole a été pas mal discuté ... il correspond assez à ce qui se fait dans le domaine, le problème pourrait venir de la protéine ... mais c'est bien là le sujet de ce post .

    Je ne sais pas exactement ce que tu as fait donc j'ai quelques questions :
    Tu fais ta purif en batch (c'est à dire pas sur colonne), c'est bien ça ?
    Es-tu sûr de mettre assez de résine pour fixer toute ta protéine ?
    Je suppose que tu mets des inhibiteurs de protéases quand tu lyses tes cellules ? Et y aurait pas d'EDTA, d'EGTA ou tout autre chélateur de nickel qui empêcherait la fixation de ta prot ?
    Tu dis mettre de l'imidazole lors de la fixation de ta prot. Tu en mets combien exactement ?
    Je fais ma purif en colonne, avec le kit invitrogen Ni-NTA.

    Je met autant de résine qu'indiqué dans la notice du kit, soit 1.5 mL pour 8mL de lysat.

    Je met bien des inhibiteurs de protéases, mais pas d'EDTA ou EGTA. J'utilise un cocktail d'antiprotéases qui ne contient justement pas ces chélateurs.

    Je met un peu d'Imidazole lors de la fixation, 10mM.

    Combien de temps dure ta purif au total, et chacune de tes étapes ? La protéine restée sur la résine aura passé plus de temps que celle non fixée dans le support où tu fais ta manip, donc là encore, elle a plus de chance d'être dégradée. Surtout si parmi les autres protéines également fixées (est-ce qu'il y en a d'autres d'ailleurs ?) il y a des protéases (qui en se fixant deviennent plus concentrées que dans ton lysat ...)
    Ma purif se déroule comme suit :

    - Sonication en glace et centrifugations successives des lysats (à 4 °C). Je conserve ensuite à 4°C pendant la nuit.

    - Le lendemain au matin, préparation de la colonne, puis incubation pendant 4 heures avec la résine en chambre froide.

    - Elution (3/4 d'heure) en chambre froide aussi.


    Question pureté, j'avais fait un bleu de Coomacie et c'est pas trop mal. Il y a de vagues traces de contaminants mais pas grand chose.


    Donc c'est un anticorps anti-ta protéine c'est bien ça ? Tu n'aurais pas un anticorps anti-6His à ton labo pour vérifier si c'est l'étiquette ou une partie de ta prot qui est dégradé ?
    Oui c'est bien un anticorps anti-maprotéine.

    Oui j'ai un anti-6His et j'ai lancé un WB. Résultats demain matin !
    Cependant ça ne colle pas au niveau des poids moléculaires ... je penche plutôt pour une dégradation de la prot. (Un tag His ne fait que 0.7 KDa, et j'ai une différence d'environ 5kDa).



    En images :

  14. #11
    Zellus

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    Désolé pour le retard mais j'étais un peu trop crevé ces derniers jours .

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Je met bien des inhibiteurs de protéases, mais pas d'EDTA ou EGTA. J'utilise un cocktail d'antiprotéases qui ne contient justement pas ces chélateurs.
    Ok, tu utilises quoi exactement ? Tu pourrais peut-être rajouter du PMSF à 2 mM (si ce n'est pas déjà la cas), ça marche assez bien .
    Et j'ai pas demandé avant : est-ce que tu mets du DTT ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Je met un peu d'Imidazole lors de la fixation, 10mM.
    Ok c'est raisonnable comme concentration. Mais peut-être que ta protéine ne se fixe vraiment pas bien, alors tu devrais peut-être ne pas mettre d'imidazole du tout avant l'élution.

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Sonication en glace et centrifugations successives des lysats (à 4 °C). Je conserve ensuite à 4°C pendant la nuit.
    Pourquoi tu fais plusieurs centrifugations ?
    La conservation toute la nuit à 4°C, alors ça c'est vraiment très risqué !! Ca ne m'étonnerait pas que ta protéine soit dégradée à ce moment-là. Il vaut mieux la conserver à -80°C.

    Citation Envoyé par Mahatmah
    puis incubation pendant 4 heures avec la résine en chambre froide
    Tu fermes ta colonne c'est ça ? Pourquoi tu incubes si c'est sur colonne ? Ce serait pas mieux de laisser tout simplement le lysat traverser ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Elution (3/4 d'heure) en chambre froide aussi
    Tu élues avec quelle concentration d'imidazole exactement ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Question pureté, j'avais fait un bleu de Coomacie et c'est pas trop mal. Il y a de vagues traces de contaminants mais pas grand chose
    C'est normal de trouver plein de contaminants dans le lysat. Comment ça se fait que tu n'es que quelques traces ? Tu fais un traitement particulier ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Oui j'ai un anti-6His et j'ai lancé un WB. Résultats demain matin !
    Alors, ce WB ?

    Citation Envoyé par Mahatmah
    Cependant ça ne colle pas au niveau des poids moléculaires ... je penche plutôt pour une dégradation de la prot. (Un tag His ne fait que 0.7 KDa, et j'ai une différence d'environ 5kDa).
    Oui tu as sans doute une partie de ta prot qui a été dégradée.
    Tu as les deux mêmes bandes dans ton éluat et ton contrôle en tout cas ^^. Mais c'est quoi ton contrôle ? Il est vraiment très faible je trouve.
    Tu as deux bandes au-dessus de ta prot dans le "surnageant". Peut-être que ta protéine s'est agrégée ...

    Voilà, désolé pour toutes ces questions !

  15. #12
    Yoyo

    Re : Purification Protéines Tag 6His

    salut

    N'aurais tu pas une modification post traductionnelle de ta protéine? ou un clivage d'une region leader par expl? Car il est peu probable que ta protéine courte existe dans ton eluat vu les différences d'intensité des bandes et que la bande de bas poid n'est pas du tout visible, alors qu'elle represente quasiement toute les proteines apres élution.

    Yoyo

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