Protocole expérimental

[invite3c320e64]

Bonjour,
je dois déterminer un protocole pour mettre en évidence la distribution de NFKB entre le cytoplasme et le noyau.Je dois utiliser le fractionnement cellulaire couplé à l'immunodétection après électrophorèse ( western blot).
Moi j'aurai d'abord fait le fractionnement cellulaire puis j'aurai mis mon broyat en présence d'anticorps primaires contre NFKB et secondaires contre l'anticorps qui s'est fixé sur NFKB.
Mais je ne sais pas à quel moment faire mon western et quel en est l'interet?Vérifier la pureté de mes fraction peut etre?
Merci
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[piwi]

Ben je ne vois pas trop ce qui vous pose problème dans le processus expérimental que vous décrivez. La première chose est de faire une simple lyse cellulaire afin de libérer les protéines cytoplasmiques. Vous centrifugez, récupérez le surnageant et vous avez votre extrait cytoplasmique. Le culot restant est constitué par les noyaux que vous lysez dans un tampon high salt. Vous centrifugez et vous récupérez le surnageant qui constitue notre extrait nucléaire soluble. Pour être au top, vous prenez votre culot qui est constitué de la chromatine et des protéines insolubles qui y sont associées. Encore un peu de tampon, un coup de sonicateur pour bien casser l'ADN et libérer les protéines. Un coup de centri et vous avez votre fraction nucléaire insoluble (chromatinienne).
Vous avez donc trois extraits qui constituent chacun un compartiment de distribution des protéines. Votre question est, dans quel compartiment se trouve ma protéine d'intérêt? Pour cela vous faites un western.

Je ne vois pas le souci conceptuel.
Maintenant on vous demande un protocole, il reste à savoir comment réaliser techniquement tout cela.

Cordialement,
piwi

[invite3c320e64]

Merci pour votre aide.
Pour la première lyse cellulaire, on la fait avec un tampon?
Merci

[piwi]

On utilise toujours un tampon. La question est, quels sont les objectifs à atteindre? Une fois que l'on sait cela c'est beaucoup plus facile.

Vous avez un avis?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3c320e64]

le but est de détruire la membrane plasmique pour libérer les protéines cytoplasmique

[piwi]

Exactement.
Et quelle est la technique classique pour casser les membranes?

[invite3c320e64]

en utilisant un détergent?

[piwi]

Perdu parce que les détergents vont vous embêter ensuite. Sauf si vous voulez les protéines membranaires c'est inutile. Il y a une méthode plus simple, que l'on voit en première année de biologie. Un truc tout bête qui fait exploser les cellules.

[invite3c320e64]

en congelant les cellules?

[piwi]

Non parce que si vous jouez avec des cycles de congélation décongélation vous allez casser aussi les noyaux et tout libérer d'un seul coup, vous ne pourrez plus fractionner.
Vous avez sans doute déjà entendu parler des chocs hypotoniques?

[invite3c320e64]

non je n'en ai jamais entendu parlé.
ça consiste en quoi?

[piwi]

C'est très simple. Il y a une certaine concentration saline dans les cellules. Si vous plongez les cellules dans une solution à une concentration saline bien inférieur à celle des cellules alors l'eau va mécaniquement entrer dans les cellules et les faire gonfler. Tellement qu'elles vont exploser.

[invite3c320e64]

je vous remercie beaucoup pour votre aide;