Caryotype

[invite0e9887ab]

Bonjour,


Je fais des caryotypes sur cellules ES et j'ai quelques difficultés. Y a-t-il quelqu'un qui pourrait m'aider ?

Je pense que la manip a fonctionné mais que la mise sur lames pose problème.
En effet, j'ai du mal à avoir un résultat satisfaisant. Les cellules éclatent pour la plupart mais les chromosomes ne restent pas tous sur place.
J'ai parfois quelques chromosomes perdus au milieu de nul part. Et parfois des cellules avec si peu de chromosomes que cela ne peut être possible.

Et enfin, il arrive souvent aussi que les cellules éclatent mais que les chromosomes ne s'étalent pas bien et restent agglomérés ce qui rend impossible leur comptage.


Bref, je ne m'en sors pas.

Merci d'avance pour votre aide !







Pour info, je "lance" des gouttes du caryotype à partir d'une hauteur d'environ 50cm-1m (je les mets à terre). Je les laisse sécher à l'air libre. Ensuite, je les colore pdt 10 min avec une solution à 1/20 de karyomax (dans de l'eau). Et je lave deux fois avec de l'eau dist avant de laisser à nouveau sécher à l'air libre.
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[invite0e9887ab]

J'ai également une autre petite question.

Le colorant doit être préparé fraichement selon le protocole mais n'y aurait-il pas quand même un moyen de le réutilisé d'un jour à l'autre car cela va revenir assez cher ?

[invite0e9887ab]

Bonjour,


Il n'y a toujours personne qui saurait m'aider ?
Je relance la mise sur lame aujourd'hui normalement. On verra bien...

[invite30157012]

Bonjour,
Je ne suis pas sûre d'avoir bien compris ta façon de procéder et pas sûre de pouvoir t'aider car je réalise des étalements de noyaux sur lames mais pas dans le but de réaliser des caryotypes. cela dit le protocole marche bien et je vois bien chromosomes. Je passe sur le début du protocole mais si nécessaire demande moi... Mes cellules sont fixées à la fin dans un mélange éthanol (3 volumes) acide acétique (1 volume). Je centrifuge et reprends dans un petit volume de fixateur. J'étale 10-12 µL/lame sur des lames superfrost prélablement lavées à l'eau milliQ et laissées à 4°C dans de l'eau. Le mélange de fixateur chasse l'eau sur la lame inclinées et les noyaux éclatent et les chromosomes restent fixés sur la lame. je regarde une 1ere lame, si les noyaux ne sont pas assez dilués pour être correctement visibles, je rajoute un peu de fixateur à ma suspension et continue mes étalements. Je laisse sécher à l'air libre. Voilà, en espérant que cela t'aide. A bientôt

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0e9887ab]

Merci pour ta réponse.
Oui, je fais plus ou moins comme ça. J'utilise du méthanol à la place de l'éthanol et pour étaler, je lâche des gouttes d'une hauteur d'environ 30cm. Et en ce qui concerne les lames, ce ne sont pas des superfrost mais de simples lames porte-objet standards.

Est-ce absolument indispensable d'avoir des superfrost ?

[invite30157012]

Honnêtement je ne sais pas si c'est indispensable, peut-être que cela aide tout de même pour une meilleure adhérence.
Sinon moi j'étale à la pipette (12 µL étalés sur la largeur de la lame que je laisse écouler en inclinant ma lame préalablement conservée dans l'eau froide à 4°C, je réalise ceci sur papier absorbant) , je ne vois pas bien l'interêt de "lâcher des gouttes"... Bon courage.

[invite0bac723f]

Bonjour,

Dans le labo de cytogénétique où j'ai travaillé, on utilisait cette technique de "laché de goutte". De mémoire il me semble que ça permettait d'avoir un étalement correcte. Ca a l'air d'etre une pratique courante, je ne crois pas que ce soit de la simple superstition de labo.
Par contre, on réalisait les étalement dans une piece à humidité controlée (impossible de me souvenir du pourcentage...), c'était censé limiter l'étalement des chromosomes. Il me semble qu'on m'avait dit à l'époque qu'on pouvait faire les étalement au dessus d'un bain-marie pour avoir plus d'humidité sur les lames.
Bon je suis désolé, j'ai pas plus de détails, c'est vieux tout ça....

[invite0e9887ab]

Bonjour !


Merci mille fois !
J'ai finalement réussi à avoir de belles lames de caryotype. J'ai utilisé des lames SuperFrost. En refaisant le processus exactement de la même manière, cela m'a donné de très bons résultats.
J'ai tout d'abord pensé à un coup de chance mais j'ai refait à nouveau la mise sur lame et, à nouveau, c'était nickel.
J'ai bien l'impression que c'était ça.

A l'occasion, si j'ai suffisamment de matériel, je le referai avec en parallèle les deux types de lame et je vous dirai ce que cela donne. Mais vu que je suis limitée par la quantité de cellules, je ne suis pas certaine de le faire.

Pour le "lâcher de goutte", je ne sais pas si c'est indispensable, mais c'était précisé dans mon protocole. Je l'ai donc fait à chaque reprise mais peut-être qu'il serait également intéressant de le tester.

Merci pour votre aide !

[invite30157012]

De rien, contente de t'avoir aidée