Bonjour,
Pouvez vous m'expliquer simplement la façon dont on "crée" une ribosonde ? Je ne comprends pas en effet ce que contient le vecteur au départ (de l'ARN ou de l'ADN), pourquoi on l'appelle "ribosonde" et pas "sonde" tout court. D'ailleurs, c'est de l'ARN la ribosonde ? Bref, merci beaucoup d'avance.
Cordialement,
Babar.
Salut,
Une ribosonde est tout simplement une sonde d'ARN. Comme elle est composée de RIBOnucléotides, on ajoute "ribo" devant "sonde" pour la différencier des sondes d'ADN.
Merci pour cette réponse!!
Et, comment peut-on la synthétiser ? Je veux dire, quel est le fonctionnement d'un vecteur (c'est de l'ADN) ?
Cordialement.
Eh bien je n'ai jamais étudié la question, mais il y a deux méthodes qui me viennent à l'esprit pour synthétiser des ribosondes. Soit tu fais une transcription in vitro à partir de la séquence d'ADN voulue, soit tu fais de la synthèse en phase solide, utilisée aussi pour faire des sondes ou amorces d'ADN et des peptides. Mais bon c'est plutôt les chimistes qui font ça ...
Bonjour,
Pour faire une ribosonde (pour 4 personnes):
Ingrédients :
- La séquence d'intérêt clonée dans un vecteur (plasmide, ADN donc) contenant un promoteur viral (T7, T3 et SP6 sont les plus utilisés).
- La RNA polymérase correspondante (T7, T3 ou SP6, donc)
- Un tampon de réaction adéquat qui contient du Tris, du MgCl2, etc.
- des ribo NTP (rATP, rUTP, rGTP, rCTP)
- du rUTP radioactif, marqué au 32P sur le posphate alpha.
- de l'eau ultra pure.
Recette.
- Mélanger les ingrédients afin d'obtenir une réaction de transcription de la séquence d'intérêt à partir du promoteur viral. Lors de la transcription, l'UTP radioactif sera utilisé et l'uracile marquée sera ainsi incorporée à l'ARN.
- Purifier la sonde radioactive sur spin colonne Sephadex G-50 ou équivalent pour se débarasser des nucléotides non incorporés.
- Servez chaud.
Ne pas oublier que la réaction de transcription ne synthétise qu'à partir d'un seul des deux brins de l'ADN. Ne pas se tromper de brin si l'on veux utiliser cette sonde pour un Northern blot.
Merci à vous deux!
