Protocole IMAC

[invitef7adfeff]

Bonjour,

J'ai effectué une transfection d'un plasmide PcDNA 3 contenant un insert codant pour une protéine recombinante possédant un Tag His (6 fois)en N-Terminal, dans des cellules adhérentes HEK-293 (eucaryote).

J'arrive à purifier sans problème mes ARNm, mais arrivé à l'étape de purification de la protéine, je dois utiliser une IMAC.

Le souci étant que je n'ai jamais travailler avec ce genre de chromatographie, et bien que comprenant le principe, je ne trouve pas de protocole pour effectuer ma purification.

Pourriez vous me donner les grandes lignes, ou un protocole pré-existant s'il vous plait.

Par la suite je compte réaliser un dessalage pour éliminer l'imidazole du tampon d'élution. Puis, la protéine sera conservée dans du PBS à 4°C.

Cordialement...
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[Zellus]

Salut et bienvenue sur Futura !

Pourriez vous me donner les grandes lignes, ou un protocole pré-existant s'il vous plait.

En général, on rajoute de l'imidazole à une concentration finale de 20 mM (pour une colonne de nickel, 10 mM max si c'est une colonne de cobalt) dans le lysat (avant le dépôt sur la colonne) et dans le tampon de lavage pour diminuer la fixation de contaminants sur la colonne. Mais si c'est la première fois que tu fais cette purif, je te conseille de ne pas en mettre et de faire un gradient lors de ton élution (on utilise généralement un tampon contenant 200-250 mM d'imidazole quand on ne fait pas de gradient). Voilà les grandes lignes. Demande si tu as d'autres questions, et surtout ne mets pas d'agents chélatants genre EDTA ou EGTA !

Par la suite je compte réaliser un dessalage pour éliminer l'imidazole du tampon d'élution. Puis, la protéine sera conservée dans du PBS à 4°C.

Les protéines se conservent plutôt à -80°C ... Mais bon ça dépend ce que tu en fais.